Seminarteil - Proteinreinigung

Question 1

Proteinreinigung Eigenschaften und Verfahren

Answer 1

• Ladung → Ionenaustauschchromatographie, Elektrophorese
• Polarität → Hydrophobe Interaktionschromatographie
• Größe → Gelfiltrationschromatographie, SDS-PAGE
• Bindungsspezifität → Affinitätschromatographie

Question 2

Gelfiltrations/größenausschluss-Chromatographie

Molekülausschusschromatographie

Answer 2

• nach Größe
• Probe auf Säule aus porösen Kügelchen
  
  • unlösliche, stark hydratisierten Polymer (Dextran, Agarose, Polyacrylamid
• Größe ca. 100 mikrometer → kleine Moleküle können in Kügelchen eindringen, große nicht
• → kleine Moleküle verteilen sich in wässriger Lösung sowohl innerhalb der Kügelchen als auch dazwischen
• Auftrennung:
  
  • große Moleküle passieren die Säule schneller, weil ein kleineres Volumen zugänglich ist
  • Mittlere, die nur ab und zu in die Kügelchen gelangen, erscheinen danach
  • kleine Moleküle gelangen als letztes aus der Säule

Question 3

Ionenaustauschchromatographie

Answer 3

• nach Nettoladung
• Protein, das bei pH=7 eine positive Nettoladung hat, wird sich an Carboxylatgruppen binden, negativ geladenes nicht
• ein so gebundenes Protein kann aus der Säule gewaschen werden, indem z.B. die [NaCl] im Elutionspuffer erhöht wird, sodass die Na⁺ mit dem Protein konkurrieren am Carboxylat

→ Proteine mit geringerer positiver Ladung velassen die Säule zuerst (weniger konkurrenzfähig), gefolgt von denen mit höherer positiver Ladung

Question 4

Affinitätschromatographie

Answer 4

• nach Affinität
• nutzt hohe Affinität vieler Proteine zu bestimmten chemischen Grppen
• z.B. Concanavalin A = ein Lecitin = ein Protein, das Kohlenhydrate bindet → mit Affinität zu Glucose
• auf Säule mit Glucosereste → Concanavalin A bindet an Säule
• kann wieder von Säule gespült werden mit hochkonzentrierte Glucoselösung → konkurriert und verdrängt die Glucosereste vom Lecithin
• sehr geeignet für Transkriptionsfaktoren (Matrix der Säule = entsprechende DNA-Fragmente; Freisetzung durch hohe Salzkonzentrationen

Question 5

Proteintags

Answer 5

Durch Tags kann das Protein quantifiziert werden

Question 6

Welche Vorteile hat eine Affinitätschromatographie gegenüber einer Größenausschluss-Chromatographie

Answer 6

• Spezifität

Question 7

Woran erkennt man sein Enzym?

Answer 7

Enzymassay

• gesuchtes Protein nur gering in Zellen vorhanden → wie isolieren?
  
  • einige Trennschritte, basierend auf physikalischen Eigenschaften
• bei gesuchten Enzymen besteht Assay aus der Reaktion, die das Enzym in der Zelle katalysiert
• Beispiel: Lactat-Dehydrogenase
  
  • Nebenprodukt NADH absorbiert Licht bei 340 nm (reduzierte Form)
  • NAD+ (ox.) nicht
  • Reaktion verfolgbar indem man misst, wv Lich das Reaktionsgemsich bei 340 nm pro Zeiteinheit absorbiert
• wichtig ist jedoch wie viel Protein insgesamt in der Lösung enthalten ist
  
  • spezifische Aktivität = Verhältnis der Enzymaktivität zur Proteinmenge im Enzymassay
  • mit fortschreitender Reinigung wird die Probe im Idealfall immer mehr Lactat-DH aufweisen und damit eine höhere spezifische Aktivität

Question 8

Gelektrophorese, SDS-PAGE

Answer 8

• nach Größe
• Gel als Molekularsieb: Moleküle, die im Verhältnis zu den Gelporen klein sind, wandern rasch; große Moleküle sind nahezu unbeweglich
• Proteine wandern im elektrischen Feld zum Pluspol, da die Nettoladung durch SDS (Natriumdodecylsulfat) aufgehoben und alle negativen Ladung tragen (von oben nach unten)
  
  • außerdem trennt SDS nahezu alle nichtkovalente WW
  • beta-Mercaptoethanol zum Entfernen der Disulfidbrücken
• Polyacylamis, da chemisch inert und leich in Herstellung
  
  • durch Polymerisation von Acrylamid, das über Methylenbisacrylamid quervernetzt ist
• Proteine können nach Gelelktrophorese in Gel angefärbt werden durch Coomassie Blau