Enzyme Flashcards
1
Q
Definition Katalysator
A
- Stoffe, die chem. reaktionen beeinflussen, beschleunigen
- bleiben selbst unbeeinflusst
- erniedrigen Aktivitätsenergie
- beschleunigen Einstellung Reaktionsgleichgewicht
2
Q
Arten von Cofaktoren
A
- Verbindung (an-/organisch)
- Durchführung chem. Reaktionen, die nicht allein mit 20 AS erolgen kann
- Inaktive Enzyme benötigen Cofaktoren
- Coenzyme –> organisch, von Vitaminen abgeleitet
- prosthetische Grupppe
- Metall
3
Q
Konzept des Überganszustand
A
- Hilft Verständnis der Enzyme
- instabile Spezies
- Befindet sich auf Gipfel des Reaktionskoordinatendiagramms
- können NICHT isoliert werden
- besitzt höhere freie Enthalpie
- Enzyme erleichtern Bildung des Übergangszustandes, senken Aktivierungsenergie
- KEIN Intermediat (–> Zwischenprodukt einer Reaktion, kann isoliert werden)
4
Q
Eigenschaften eines Enzym-Substrat-Komplex
A
- Begünstigt Übergangszustand
- Katalyse findet an einer bestimmten Stelle statt: aktiver Zentrum
- V_max Hinweis auf Bildung definierter Enzym-Substrat-Komplexe
5
Q
Eigenschaften von aktiven Zentren
A
- bindet Substrat und falls vorhanden, den Cofaktor
- Reste im aktiven Zentrum nennt man katalytische Gruppe
- wird durch dreidimensionale Spalte im Enzym gebildet
- besteht aus unterschiedlicher Abschnitte der AS-Sequenz
- kleiner Teil des Gesamtenzyms
- schaffen besondere Mikroumgebungen
- Substrate werden durch viele schwache WW an das Enzym gebunden
6
Q
Schlüssel-Schloss-Prinzip
A
- Substrat passt perfekt in Enzym
- Emil Fischer
- AZ komplementäre Gestalt zu substrat
7
Q
Induced fit Modell
A
- Daniel Koshland
- AZ verändert Form bei Substratbindung
8
Q
Reaktionsordnung
A
- Beschrieben durch das Zeitgesetz des makroskopisch beobachtbaren Vorgangs
- basiert auf Meddung zeitlicher Veränderungen von Konzentrationen
9
Q
Reaktionen 1. Ordnung
A
- Ordnung: A –> P ;
- v entspricht Menge an A, die in bestimmter Zeiteinheit verschwindet, bzw. P auftritt/entsteht
- k = Geschwindigkeitskonstante [s-1]
10
Q
Reaktionen 2. Ordnung
A
- 2 A –> P
- A + B –> P
- k = [M-1 s-1]
11
Q
Michaelis-Menten-Kinetik
A
- mit steigender Substratkonzentration steigt auch die Reaktionsgeschwindigkeit
- asymptotisch angenähert an Vmax
Bestimmung der Anfangsgeschwindigkeit
- abhängig der Substratokonzentration
- bei gleicher Enzymkonzentration
12
Q
KM-Wert
A
- Substratkonzentration, bei der die reaktionsgeschwindigkeit die Hälfte des Maximalwertes erreicht hat
- Maß für Substratkonzentration, die für eine nennenswerte Katalyse erforderlich ist
- Maß für Stabilität des ES-Komplexes
13
Q
Michaelis-Menten-Gleichung
A
14
Q
Maximalgeschwindigkeit
A
- Erreichen vmax wenn [ES]=[E]T
- Bei sehr hohen Substratkonzentration ist vmax = v0
15
Q
Lineweaver-Burk-Auftragung
A
- Doppeltreziprokes Diagramm
16
Q
Wechselzahl
A
- kcat
- maximale Zah umgesetzter Substratmoleküle pro Zeiteinheit bei Sättigung mit Substrat
17
Q
Katalytische Effizienz
A
- kcat/KM
- physiologisch is [S] weit unter KM
- enzymatische Geschwindigkeit weit unter kcat
- Maß für katalytische Effizienz
- Berücksichtigung bestimmtes Substrat
- erücksichtigung der Stärke der Wechselwirkung
- Präferenz eines Enzyms zu verschiedenen Substraten testbar
- Scheinbare Geschwindigkeitskonstante 2. Ordnung
- maximalwert ca. 108 - 109 M-1s-1
- Kriterium für Spezifität und Effektivität beim Verglecih von Enzymen bzw. Substraten
- Je größer, desto besser ist das Enzym zur Umsetung
Die Diffusionskontrollierete Interaktion von Substrat und Enzym bestimmt die Obergrenze der Rate
18
Q
Enzymmechanismen mehrerer Substrate
A
- Sequenzielle Verdrängung
- geordnete sequenzielle Verdrängung
- zufällige sequenzielle Verdrängung
- Doppelte Verdrängung (Ping-Pong-Reaktion)
19
Q
Sequenzielle Verdrängung
A
- Es müssen beide Substrate an das Enzym binden, bevor ein Produkt freigesetzt wird
- Bildung eines Ternären Komplexes
20
Q
geordnete sequenzielle Verdränung
A
- Coenzym bindet zuerst
- Produkt wird zuletzt freigesetzt
- Beispiel: Lactat-Dehydrogenase
21
Q
zufällige sequenzielle Verdrängung
A
- reihenfolge einzelner Ereignisse zufällig
- Beispiel: Keratin Kinase
22
Q
Doppelte Verdrängung
A
- ein oder mehrere Produkte werden freigesetzt, bevor alle Substrate an das Enzym gebunden haben
- Bildung eines substituiertes Enzym-Zwischenprodukt
- Enzym zeitweilig modifiziert
- Beispiel: Aspartat-Aminotransferase
23
Q
Welche Reaktionen gehorchen nicht der Michaelis-Menten-Kinetik
A
- allosterische Enzyme
- mehrere UE
- mehrere aktive Zentren
- sigmoide Kurven
- Substratbndung an einem aktiven Zentrum kann Eigenschaften anderer aktiven Zentren beeiflussen
- kooperative Substratbindung
24
Q
Enzymhemmung
A
- Verringerung der Aktivität eines Enzyms durch Bindung eines spezifishen kleinen Moleküls
- bedeutender Kontrollmechanismus
- viele Medikamente und toxische Stoffe wirken auf diese Weise
- Übergangszustandsanaloga
25
Arten der Enzymhemmung
Irreversibel
* langsame Dissoziation
* sehr fest, kovalent gebunden
Reversibel - schnelle Dissoziation
* kompetitiv
* Bindung entweder Substrat oder Enzym
* Verringerung durch Substraterhöhung
* nicht-kompetitiv
* unterschiedliche Bindungsstellen
* Ungebundenes Enzym oder ES-Komplex
* erniedrigt funktionelle Enzymkonzentration
* unkompetitiv
* Bindung an ES-Komplex
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Allgemeine Katalytische Strategien
* Kovalente Katalyse
* Allgemeine Säure-Base-Katalyse
* Katalyse durch Annäherung
* Metallionenkatalyse
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Kovalente Katalyse
* temporäre Ausbildung kovalente Bindung
* aktiver Zentrum
* meist Nukleophile kovalente Katalyse
* Chymotrypsin (Proteasen)
28
allgemeine Säure-Base-Katalyse
* Enzym als Protonendonator und -akzeptor
* Chymotrypsin/Carboanhydrasen
29
Katalyse durch Annäherung
* erleichterung der Reaktion
* zwei Substrate in richtige Orientierung bringen
* NMP-Kinasen, ADenylat-Kinasen
30
Metallionenkatalyse
* wirken als Elektronendonatoren oder -akzeptoren
* als Lewis-Säure
* Bereitsteller von Hydroxidionen
* Carboanhydrasen/Restriktionsenzyme
31
Proteasen
* Hydrolytische Spaltung einer Peptidbindung
* Rückgewinnung der AS aus der Nahrung im Darm
* hydrolytische Reaktion: Addition eines H2O-Moleküls
* sehr langsame Reaktion trotz thermodynamische Begünstigung
* Doppelbindungscharakter der Peptidbindung
* C-Atom weniger elektrophil --\> weniger zugänglich für nucleophilen Angriff
* proteolytisches Enzym muss nucleophilen Angriff auf eine nicht reaktive Carbonylgruppe ermöglichen
32
Chymotrypsin
* Protease
* Verdauungsenzym
* Spaltung Peptidbindungen an Carboxylseiten aromatischer und hydrophober AS
* Trp, Tyr, Phe, Met
* kovalente Modifikation
* Serinrest als stark nucleophile Gruppe, nucleophiler Angriff an C-Atom der Peptidbindung
* katalytische Triade
33
Aufbau von Chymotrypsin
* aus drei Ketten
* vier Disulfidbrücken
* katalytische Triade des aktiven Zentrums
* Asp[102], His[57], Ser[195]
* katalytische Aktivität beruht auf Reaktivität des Serinrestes
* Aspartat
* dient Ausrichtung Histidin
* WBB und elektrostatische WW bewirken, dass His zu besserem Protonenakzeptor wird
* Histidin
* positioniert Serin
* polarisiert Serins Hydroxylgruppe
* dient als Akzeptor für Proton
* Basenkatalysator
* Serin
* wird deprotoniert
* führt zur Ausbildung eines Alkoxidions
* starker nucleoophil
* 3D Struktur zeigt, dass Chymotrypsin große hydrophobe tasche hat
* bevorzugt AS-reste mit hydrophoben Seitenketten
34
Katalytischer Mechanismus von Chymotrypsin
**Acylierung**
* substratbindung
* **nucleophiler angriff** des O-Atoms in der Serinseitenkette auf Carbonylkohlenstoffatom der Zielpeptidbindung
* C-atom zuvor planar (3 Substituenten9
* durch 4. Substituent: instabiles **tetraedisches Intermediat**
* O-Atom der Carbonylgruppe formal negativ geladen--\> wird durch NH-Gruppen stabilisiert: **Oxyaniontasche**
* Zwischenprodukt zerfällt und es entsteht das Acyl-Enzym: H+ von His auf Aminogruppe, die bei Spaltung der Peptidbindung entsteht
* Aminogruppe löst sich von Enzym
**Deacylierung**
* H2O nimmt platz von vorheriger Aminkomponente ein
* Estergruppe des Acyl-Enzyms wird hydrolysiert durch Wdh der Schritte 2-4
* His wirkt als Säurekatalysator und entzieht H2O Proton
* OH-, welche Carbonylkohlenstoff der Acylgruppe angreift
* tetraedisches Zwischenprodukt
* Struktur zerfällt, Carbonsäure entsteht
* nach Freisetzung liegt Enzym wieder für neuen Katalysezyklus bereit
35
Messung Effektivität von Chymotrypsin mit chronogenem Substratanalogon
* N-Acetyl-L-Phenylalanin-p-nitrophenylester
* viele Proteasen können auch Ester spalten
* gelbes Produkt: **p-Nitrophenolat**, Konzentration kann durch Lichtextinktion gemessen werden
* Anfangsphase durch **stopped-flow-Verfahren** bestimmbar
* ermöglicht schnelle Vermischung
* Ergibnisse innerhalb von millisekunden beobachtbar
* Zu beginn: burst = Phase des schnellen Anstiegs
* sobald GGW erreicht, entsteht produkt langsamer
* Ergebnisse deuten auf zweiphasige Hydrolyse hin
* kovalent verknüpftes Zwischenprodukt (intermediat)
36
Katalytische Triaden anderer hydrolytischer Enzyme
* Trypsin
* spaltet positiv geladenen resten
* enthält Asp 189, welcher positiv geladene Substrate anzieht und stabilisiert
* Spaltung an Carbonylseite von Lysin und Arginin
* Elastase
* Spaltung an Carboxylseite von hydrophoben AS mit kleinen SK (Gly, Val, Ala, Leu, Ile)
* zwei Valinreste verkleinern hydrophobe Tasche
37
Evolutionäre Entdeckungen von katalytischen Triaden
* Protease in Bakterien
* **Subtilisin**
* katalytisches Zentrum mit oxyaniontasche
* NH-Gruppe der Oxyaniontasche gehört zu Asp-Rest (nicht vom Proteinrückgrat
* Proteasen mit Serin/Threonin im AZ
* Aktivierung nicht durch His-Asp-Paar
* sondern durch primäre Aminogruppe in SK von Lysin
* oder durch aminoterminale Aminogruppe der Polypeptidkette
⇒ Evolutionär mindestens drei Mal entstanden
38
Alternativen zu Serin-Proteasen
* Cysteinproteasen
* von His aktiviert
* Schwefelatom stärkeres Nukleophil
* keine Triade
* Aspartatproteasen
* ein Paar Asn wirken zusammen, sodass ein H2O Peptidbindung angreifen kann
* Metalloproteasen
* AZ enthält Metallion
* fast immer zink
* aktiviert H2O
* Wirkung ebenfalls mit nekleophile Gruppe
* nukleophiler Angriff der Peptidcarbonylgruppe
* Bildung eines tetraedischen zwischenproduktes
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Carboanhydrasen
* Bestandteil von Erythrozyten
* dient CO2 transport
* machen schnelle Reaktionen schneller
* Hydratisierung und dehydratisireung
* GGW wird in grade benötigter Richtung verschoben
* in Lunge wird HCO3- dehydratisiert und CO2 abgegeben
* Carboanhydrase enthält Zink Zn(II)
40
Aufbau Carboanhydrase
* Zink
* Zn(II)
* einzige Oxidationsstuffe in BC
* an 4 Liganden gebunden
* drei neutrale His und ein H2O ( bzw. Hydroxid, je nach pH)
* verzerrt tetraedische Koordinationsgeometrie
* pH-Wert abhängig
41
pH-abhängige Aktivierung des Nukleophils
* maximale Geschwindigkeit bei pH = 8
* Umkehrpunkt bei pH 7
* deprotonierung des Wassers
* hydroxision nukleophiler als Wasser
* Besserer Angriff auf CO2
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Mechanismus der Carboanhydrase
* Hydroxid-Generierung
* CO2-Bindung
* nukleophiler Angriff des OH- auf C
* Stabilisierung der entstehenden negativen Ladung durch Zn2+
* regenerierung des AZ durch Abspaltung des HCO3-
43
Restriktionsenzyme
* Restriktionsendonukleasen
* zerschneiden Nukleinsäuren
* Beispiel: Schutz vor viraler DNA
* hoch-spezifisch
* können DNA Wirtszelle nicht zerschneiden
* nur fremde DNA-Moleküle
* Erkennungssequenz EcorV aus E.coli: 5'-GATATC-3'
44
Mechanismen Restriktionsenzyme
1. kovalent gebundenes Zwischenprodukt
2. direkte Hydrolyse
* bei beiden. in-line Veerdrängung
44
In-Line-Verdränung
* Nucleophiler Angriff auf P
* fünffach koordinierter übergangszustand entsteht
* zweifach pyramidal
* eintretende Gruppe an Spitze und Abgangsgruppe gegenüberliegend
* stereochemische Konformation kehrt durch Verdrängung am tetraedisch substitueierten P-Atom um
* Mechanismen unterscheiden sich in der Anzahö der verdrängungen
1. Mechanismus
* zwei Verdrängungsreaktionen
* stereochemische Konfig. am P-Atom ändert sich 2mal
* stereochemische Konfig bleibt erhalten
2. Mechanismus
* nur ein mal
* stereochemische Konfig. wäre umgekehrt
45
Welches Element benötigen Restriktionsenzyme und Warum?
* Enzyme, die mit phosphorhaltigen Substraten reagieren benötigen bivalente Kationen für Aktivität
* **Mg2+**
* Koordination erfolgt über zwei Aspartatreste, sowie O-Atom der Phosphorylgruppe
* Wasseratom, dass P ngreift, wird von Mg2+ gebunden
* dient der **Positionierung** und **Aktivierung**
46
Substraterkennung von Restriktionsenzymen
* inverted repeats
* blah
47
Wie schützt sich die Wirtszell-DNA von den restriktionsenzymen
* Methylierung
* Methylase
* für jede Restriktionsendonuclease produziert Wirtszelle methylase
* **Restriktions-Modifikations-Systeme**
48
Nukleosidmonophosphat-Kinasen
NMP-Kinasen
* Übertragung von Phosphorylgruppen durch NMP-Kinasen ohne vorherige Hydrolyse
* **NTP-core-Domäne**
* zentralem ß-Faltblatt
* an beiden Seiten von α-Helices umgeben
* Schleife zwischen ß-Strang und α-Helix: **P-Loop**
* da mit Phosphorylgruppen des gebundenen Nukleotids in Wechselwirkung
49
fünf Prinzipien der Enzymregulation
1. Allosterische regulation
2. Isozyme
3. reversible kovalente Modifikation
4. proteolytische Aktivierung
5. Regulation durch vorhandene Enzymmenge
50
Allosterische Regulation
* Interaktion zwischen **regulatorischen Zentren** und **aktiven Zentren**
* **Kooperativität**
* häufig **Rückkopplungshemmung**
* Beipsiel: Aspartat-Transcarbomylase
51
Isozyme
* verschiedene enzymformen
* Auftritt in verschiedenen Geweben
* katalysieren gleiche Reaktion
* unterschiedliche KM und vmax Werte
52
reversible kovalente Modifikation
* Veränderung katalytische Aktivität/Funktion
* durch kovalente Modifikation
* häufig **Phosphorylierung** (ATP)
* Bsp: Proteinkinase A (PKA)
53
proteolytische Aktivierung
* inaktive vorstufen
* **Zymogene/Proenzyme**
* Aktivierung durch Proteolyse
* Bsp: Verdauungsenzyme (Chymotrypsin, trypsin, Pepsin9
54
Aspartattranscarbamoylase
* **Schrittmacherreaktion**
* katalysiert ersten Schritt der Biosynthese von Pyrimidinen
* Kondensation Aspartat mit Carbamoylphosphat
* Produkt: N-Carbamoylaspartat und Orthophosphat
* am Ende der Synthese entsteht **Cytidintriphosphosphat**
* Endprodukthemmung=**Rückkopplungshemmung**
* bei steigender CTP-konzentration sinkt Reaktionsgeschwindigkeit
* CTP bindet an allosterisches/regulatorisches Zentrum
* **allosterische Inhibitor**
55
PALA
* N-Phosphonacetyl-L-Aspartat
* Bisubtratanalogon
*
56
Homotropische Effekte
* Wirkung Subtrat auf allosterische Enzyme
* Kooperativität
* sigmoide Kurve
57
Heterotropische Effekte
58
Allosterische Regulatoren von ATCase
* Vorhandensein CTP schiebt GGW zur T-Form von ATCase
* verlängert Anfangsphase der Kurve
* ATP entgegengesetzer Effekt: erhöht Reaktionsgeschwindigkeit
* ATP und CTP konkurrieren
* hohe ATP Konzentration
* Enzym kann nicht von CTP gehemmt werden
* signalisiert hohe Purinnekleotidkonzentration
* Verhältnis Purin : Pyrimidin muss ausgeglichen wereden
59
Arten der kovalenten Modifikationen zur Regulation von Enzymaktivität
* Phosphorylierung
* meist reversibel
* Acetylierung
* bei Histonen Lysinrest
* Transkriptionserhöhung
* Ubiquitinierung
* irreversibel
* Signal zur Zerstörung von Proteinen
* Anhängung Lipid
* irreversibel
* Verankerung in Plasmamembran
60
Phosphorylierung durch Protein**Kinasen**
Wirkungen
* Hinzufügung **zwei negative Ladungen**
* ****veränderte Elektrostatik
* veränderte protein-Protein-Liganden-Wechselwirkung
* eine Phosphorylgruppe kann drei oder mehr **WBB** ausbilden
* hohe **freie Enthalpie**
* ****freie Enthalpie im Protein enthalten
* verschiebung von konformationellen GGW
* **variabler zeitraum** Phosphorylierung und Dephosphorylierung
* einstellbar zu physiologischen Anforderung entsprechend
* Phosphorylierungen als **Verstärkersignale**
* ****aktivierung **Kinase**
* katalyse weiterer Phosphorylierungen
* Verwendung ATP als Donor koppelt Stoffwechsel an **Energiestoffwechsel** der Zelle
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Dephosphorylierung durch Protein**phosphatasen**
* Dephosphorylierung und Phosphorylierungen sind nicht einfach Umkehrreaktionen
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Aktivierung durch spezifische Proteolyse
* Verdauungsenzyme
* Blutgerinnung
* Proteinhormone
* Kollagen von Prokollagen abgeleitet
* Entwicklungsprozesse
* Caspasen (Zelltod)
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Aktivierung von Chymotrypsin
* syntheseort Pankreas (Acinuszellen)
* gespeichert in membranumhüllten Granula
* Chymotrypsinogen
* einzelne Polypeptidkette aus 245 AS
* Spaltung Peptidbindung zwischen Arg 15 und Ile 16 durch **Trypsin**
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Aktivierung von Trypsin
* 4 Abschnitte des Polypeptids verändern sich durch die Aktivierung deutlich
* Trypsin - gemeinsamer Aktivator aller Zymogene des Pankreas
* initialer Aktivierungsschritt
* irreversibel
* Beendigung durch anderen Mechanismus, z.B. Pankreas-Trypsininhibitor
