Sem4 Flashcards
Qu’est ce que l’electrophorese de DNA sur gel?
Technique utilise pour séparer des molécules en fct de leur taille, de leur charge, de leur forme.
Pk applique t’on un champ électrique pour l’électrophorese de DNA sur gel?
Permet de déplacer les molécules chargées à travers le gel à des vitesses différentes
Pk utiliser un gel d’agarose?
Pour séparer les fragments d’ADN ou ARN car:
-Taille des pores adaptée
-Facile à manipuler (thermo stable)
-substance inerte; elle n’interagit pas chimiquement avec les molécules qu’elle sépare
-transparence
-non toxique
En baissant la température comment agit le gel d’agarose?
Comme un filet de pêche
Dans quel direction l’ADN migre avec l’éctrophorese sur gel?
Vers pôle positif car l’ADN est tjrs chargé négativement
Dans quelle direction les protéines se déplacent dans l’electrophores pour gel?
Cela dépend si protéine chargée positivement ou négativement
Qu’ajout t’on pour que les protéines se déplace vers le pôle positif?
Du sodium dodecyl sulfate (SDS) (ajoute charge négative)
Lorsque les pièce d’ADN sont séparé sur le gel d’agarose, la relation taille-mobilité est linéaire?
Faux
Qu’indique le Marker de l’électrophone de sur gel?
Le nbre de nucléotide et donc la taille des fragments
Dans un marker d’électrochoc est sur gel où se situe le pôle négatif? Et le positif?
Négatif en haut et positif en bas
Comment le DNA peut être quantifié avec l’électrophone de de gel agarose?
Pas compris se renseigner
Comment visualiser le DNA dans un gel d’agarose?
Ajouter un colorant
Quel colorant ajoute t’on à l’ADN?
Bleu de Coomassie
Quel type de lumière utilise t’on pour voir les fragments d’ADN? Pk elle?
Lumière uv car elle excite les électron-> fluorescent
Quel type de lumière utilise t’on pour voir les fragments d’ADN? Pk elle?
Lumière uv car elle excite les électron-> fluorescent
Quelle quantité de protéine peut être détectée avec le bleu de Coomassie?
0.1 ug ou 100ng
Quelle différence de masse minimum doit il y avoir entre deux protéines pour être séparée?
2% (50 et 51kDa)
À quoi servent les enzymes de restriction?
-Coupe les deux brins d’ADN?
- réaction d’hydrolyse
Qu’est ce qu’une réaction d’hydrolyse?
Une molécule est dissociée en plus petite molécule par l’ajout d’une molécule d’eau
Quelle type de séquence les enzymes de restriction coupent elles toujours?
Des séquence palindromiques
Qu’est ce qu’une séquence palindromique?
Séquence d’ADN qui se lit de la même façon dans les deux directions sur les deux brins complémentaires
Pk est ce que les enzymes de restrictions coupent tjrs des séquences palindromique?
Ces séquences leur permettent de se fixer spécifiquement et de cliver l’ADN de manière précise
Que sont les enzymes de restrictions?
Ce sont des homo-dimeres
Qu’est ce qu’un homo-dimeres?
Une protéine constitué de deux sous unités identiques en terme de séquence d’aa
En quoi le fait que les enzymes de restriction soient des homo-dimere influencent qu’elle coupent que des séquences palindromique ?
La reconnaissance est facilité, chaque sous unité de l’homo-dimere peut se lier à 1 brin d’ADN. Chaque sous unité se lie avec 3 bases sur le brin d’ADN-> forme une structure stable
Citer 5 enzyme de restriction
BamHI
EcoRI
Haelll
Hhal
Xhol
D’où viennent les enzymes de restriction? Citer 2 noms précis
Des bactéries :
-Escherichia Coli
-Haemophilius aegyptius
Cbm d’enzyme de restriction sont isolés des bactéries?
Plus de 1000
Pourquoi les bactéries produisent des enzymes de restriction?
C’est un mécanisme de défense contre les agents pathogène
Quelle bactérie produit EcoRI?
Escherichia Coli
Pk l’ADN des bactéries n’est pas clivé?
Les bactéries produisent des methyltransférase qui ajoutent des groupes méthyle à leur propre ADN. Grâce à ce méthyle, les bactéries peuvent différencier leur ADN autochtone de l’étranger
À quoi sert les enzyme de clivage? Comment s’en sert on en biologie?
Couper l’ADN à des endroits précis. Permet le clonage, l’assemblage de gène et l’analyse génétique
Qui est quand a découvert les enzymes de restriction?
Werner Arber et Hamilton O. Smith vers 1978
Qui est Daniel Nathans?
C’est la première personne à avoir utilisé les enzymes de restriction
Pour quel application est-ce qu’on pourrait utiliser les enzymes de restriction
-l’analyse de longue molécules d’ADN
Comment sont analysées les longues molécules d’ADN?
-les fragments d’ADN sont comparés à une échelle de poids moléculaire pour déterminer leur taille
- on créé un profil de restriction
À quoi est utile le profil de restriction?
Analyse de polymorphisme
Type de souches bactérienne
Comparaisons de variations génétique
Cbm de fois l’enzyme BamHI a coupé le DNA du lambda phage?
5x, car on trouve la séquence GGATCC 5 fois dans le virus. Par ailleurs sur le marker il y a 5 traits
Cbm de fois l’enzyme BamHI a coupé le DNA du lambda phage?
5x, car on trouve la séquence GGATCC 5 fois dans le virus. Par ailleurs sur le marker il y a 5 traits
Qu’est ce qu’un technologie du DNA recombinant?
Technique génétique qui permet de manipuler des gènes en insérant des fragments d’ADN d’une espèce dans le génome d’un autre espèce
Quels sont les étapes de la technologie du l’ADN recombinant?
- Isolement de l’ADN
- Utilisation d’enzyme de restriction
- Insertion dans un vecteur
- Introduction dans une cellule hôte
5.multiplication et expression du gène
Que trouve t’on dans une bactérie?
Son adn et des plasmides
Qu’est ce que l’ADN génomique de bactérie? Par ex de E.coli?
4.6 million de nucléotide , contient tout les gènes de la bactérie
Qu’est ce que le plasmide de l’ADN?
ADN circulaire (environ 4000 nucléarisés, peut se répliquer de façon autonome dans la bactérie )
Pour recombiner de l’ADN, pk isolé t’on deux brins de plasmides?
On s’en sert comme un vecteur ou on va insérer le fragment d’ADN coupé
Que va t’il se passer avec le plasmide modifier?
Introduit dans une cellule hôte, il va se multiplier en répliquant l’ADN recombinant
Si l’ADN inséré contient un gène qui code une protéine que va reproduire la cellule?
La cellule va également produire cette protéine en fct des instructions génétiques insérées
Grâce à quoi clive t’on le plasmide et l’ADN extérieur?
Grâce a des enzymes de restrictions qui crée des extrémités cohésives
Qui a découvert la séquence des aminoacides de l’insuline et a developpé une méthode pour séquencer l’ADN?Quand ?
Frédérick Sanger en 1953 et 1970
Qui a découvert la séquence des aminoacides de l’insuline et a developpé une méthode pour séquencer l’ADN?Quand ?
Frédérick Sanger en 1953 et 1970
Comment Frédérick Senger séquençait l’ADN?
- Amplification de l’ADN
- Mélange avec des nucléotides et une amorce (amorce et adn polymérase et des nucleotides classiques)
3.ajout de nucleotides modifiés - Terminaison de la chaîne
- Electrophorese en gel
Quels sont les 4 types d’ajout nucleotides didesoxyribonucleotides ? (dNTP)
dATP
dCTP
dGTP
dTTP
L’amorce arrive de quelle sens sur le brin complémentaire du gène à séquencer?
5’->3
Pk une matrice (brin d’ADN à séquencer) est lié de 3’ vers 5’?
La direction alité 5’ vers 3’ est une caractéristique des acides nucléiques et des enzymes que les synthétise comme l’ADN polimerase .
La matrice est donc lié de 3’ vers 5’ pour que la synthèse se fasse de 5’ vers 3’
Sur un brin d’ADN où est situé le phosphate libre?
Extrémité 5’
Sur le brin d’ADN ou se situe le groupe hydrolysée libre?
3’
Dans quelle sens est l’amorce de l’ADN?
5’ vers 3’
À quoi servent les ADN polymerase?
1.Répare l’ADN et élimine les amorces d’ARN lors de la réplication
- Responsable de la réplication de l’ADN chez les bactéries
Comment l’ADN polymerase catalyse la ligation des nucleotides?
Elle ajoute des nucleotides complémentaires au brin d’ADN matrice. Repose sur la liaisons phosphodiester entre les nucleotides
L’ADN polymerase peut commencer la synthèse de l’ADN à partir de rien?
Non besoin d’une amorce avec une extrémité 3’-OH libre
L’élongation de el’amorce se fait dans le sens 3’ -> 5’?
Nan l’inverse
Quelle est la différence entre un dATP et le di-deoxy-ATP?
Le ddATP (manque d’un groupe hydroxyde) est utilisé comme terminateur de chaîne dans le séquençage Sanger. Par conséquent, comme ils sont ajoutés en faible quantités,la synthèse de l’ADN s’arrête
À quoi sert l’incorporation aléatoire de ddATP ddGTP ddCTP ddTTP dans la chaîne de croissance?
Une série de fragment d’ADN s’arrête à chaque position où il y a les bases. Les autre avc les dTP continuent.
On peut déterminer la séquence complète de l’ADN
Grâce à quoi voit on les nouveau fragment d’ADN après le séquençage de Sanger?
Grâce à l’électrophorese sur gel
Si en dessous de A il y a un trait à côté de 8, qu’est ce que cela dit?
Il y a un thymidine en position 8 car fragement de 8 nucleotides s’arrête avec un thymidine
On lit l’electrophores de bas en haut?
Oui
Sur l’électrophores sur gel en bas c’est 5’ en haut c’est 3’?
Comment remettre la matrice?
Oui mais c’est la séquence inverse de la matrice! Chercher la complémentarité pour 3’ vers 5’
Dans les méthode moderne de séquençage de Sanger, comment visualise t’on les fragments d’ADN terminés par un ddTP?
Des fluorophores
En 1990 comment visualisait t’on les séquence d’ADN avec méthode Sanger?
Marqueurs radioactif
Quelles est l’avantage des di-deoxy-nucleotides fluorescents?
1 seule éprouvette et pas 4 réactions //
Quelle couleurs est C?
A?
G?
T?
Violet
Vert
Noir
Rouge
Comment séquencer un génome humain entier avec la méthode de Sanger? (Génome humain = 3 miliaire de nucleotides)
En fragmentant le génome
Qui a developé la réaction en chaîne par polymerase (PCR)? Quand?
Kary Mullis en 1985
Quelles sont les étapes de la PCR?
- Dénaturation
- Chauffer 94-98°
- Séparation des 2 brins?
2.hybridation
1. Refroidir 50-65 °
2. Les amorces d’hybride aux brins simple d’ADN
- Élongation
- Chauffer 72°
- Polymerase ajoute des nucleotides aux amorces
-> synthétise de nouveaux brins d’ADN complémentaires en utilisant les brins simples comme matrice
Grâce au PCR cbm de copie d’ADN par cycle?
2^ nbre cycle
