RNA Quality control in Eucaryotes

Question 1

Auf welchen Wegen entstehen nonsense-mRNAs?

Answer 1

Mutation des Genoms (ca. 30% aller krankheitsauslösenden Mutationen erzeugen ein PTC)

Alternatives Splicing (45% aller alternativ gespliceten pre-mRNAs haben vorraussichtlich mindestens ein Spliceschema mit PTC)

Nonproductive V(D)J rearrangements of immunoglobulin superfamily
(Ig/TCR) during lymphocyte maturation
-Due to imprecise segment joining, 2/3 of rearrangements will shift the
reading frame and hence produce a PTC

Question 2

nenne vier Krankheiten, die durch nonsense mutationen ausgeköst werden

Answer 2

Duchenne/Becker Muskeldystrophie
cystische Fibrose
Hemophilie a und b
methylmalonische Academia

Question 3

Was ist der Zweck von Nonsense mediated Decay (NMD)

Answer 3

*NMD largely functions to down-regulate the level of abnormal transcripts that are a consequence of routine abnormalities in gene expression, such as nonproductive alternative splicing.

*This is because the resulting protein could function in dominant-negative fashion or in other ways that are deleterious to cells.

*As such, NMD can be viewed as a type of “mRNA quality control” or
“mRNA surveillance” mechanism.

Question 4

Betrift NMD nur fehlerhafte mRNA?
Weswegen?

Answer 4

Nein

dient als Expressionsregulation.
Betrifft 5-15% aller mRNA in Hefe, drosophila oder Mensch
homöostatische Feedbackregulation

Question 5

Was gnau erkennt NMD?

Answer 5

PTC in allen Exons bis auf das letzte Exon und die letzten ~55nt des vorletzten Exons

Question 6

Nenne vier Einflüsse auf NMD, sowie deren genauen Einfluss

Answer 6

Medikamentenbedingte Translationsinhibition (NMD aufhebung)

Starke Sekundärstrukturen in 5’UTR (NMD Blockade)

Suppressor tRNA (partielle Umkehr)

Mutation in Kozak-Sequenz (nicht genauer definiert)

Question 7

Welche drei mögliche Modelle gibt es, mit welchen ein PTC erkannt wird?

Answer 7

Upstream Marker model

Downstream Marker model

Faux-3’ UTR model

Question 8

Beschreibe die Erkennung von PTCs in Hefe

Answer 8

Downstream Marker model:

Downstream element binding protein gebunden an mRNA. in normaler RNA entfernt bei erster Translation (pioneer round)

Bei PTC: DBP bleibt an RNA durch Stop von Ribosom an PTC. Interaktion von DBP mid kern-NMD faktoren initiiert Abbau

Question 9

Welche Proteine binden bei Menschen an mRNA und sind verantwortlich für NMD?
Wo binden diese?

Answer 9

Exonic Junction Complexes

ca. 20-24 nt vor Verbindungsstelle zweier Exonen

Question 10

Beschreibe den mRNA Abbau durch NMD nach Erkennung des Stopcodons

Answer 10

Ribosom stoppt, Phosphorilierung von UPF1 durch SMG1

P-UPF1 interagiert mit SMG6 -> exonukleolytischer mRNA Spaltung
P-UPF1 interagiert (gleichzeitig mit SMG6) mit SMG 5 und 7 -> rekrutierung von deadenylierungs- und decappingmechanismen

Folge: Decapping und exonukleolytischer 5’-3’-Abbau durch XRN1; deadenylierung und 3’-5’ Abbau durch deadenylase und Exosom

Question 11

Beschreibe das faux 3’UTR-Model

Answer 11

• proximity between the normal stop codon and PABPC1 bound to the poly(A) tail, favours termination and translation re-initiation over induction of mRNA decay
• at a PTC, the stop codon is not in the appropriate position relative to poly(A) tail
• The long 3‘-UTR following the PTC is not bringing PABPC1 to the proximity of release factors bound at the termination codon.
• ribosomes that terminate prematurely are released less efficiently favouring the assembly of NMD complex proteins, leading to degradation of the mRNA

Question 12

Was ist die Bedingung für Erkennung des PTC durch EJC und warum?

Answer 12

PTC in höchstens 50 nt zu Exon Junction.
Grund: EJC 20-24 nt upstream of Junction. Erkennung bei zu geringer Distanz nicht möglich

Question 13

Nenne fünf weiter Ziele für NMD

Answer 13

• Transkripte nicht funktionaler Pseudogene
• Transkripte von Transposons oder LTRs
• Transkripte mit Upstream Open Reading Frame in 5’UTR
• Transkripte, die aus Kernretention ausgebrochen sind
• mRNA mit UGA-triplet (Selenocystein oder Stopcodon), abhängig von intrazellulärem Se-Level

Question 14

Nenne zwei weitere Funktionen von NMD

Answer 14

Reduktion von genomic noise
Regulation von Expression

Question 15

Nenne sieben Prozesse, in welchen NMD die Expression physiologischer mRNA reguliert

Answer 15

Stressantwort
Haemopoetische Stammzellentwicklung
Regulation alternativer Spliceformen
Genomstabilität
Zellzyklusfortschritt
Telomerlängenwahrung
embryonische Entwicklung

Question 16

Nenne drei Prozesse, in welchen NMD unterdrückt wird

Answer 16

Integrated Stress Response (ISR)
-Expression von NMD target proteinen nötig für Stressantwort

Abfangen von Reactive Oxigen Species
-Stabilisierung von SLC7A11 mRNA (NMD target) -> Expression von SLC7A11 -> Cysteinimport für Gluthationsynthese zum Abfangen
von ROS

Unfolded Protein Response
-reguliert durch NMD

Question 17

Welchen Autoregulationsmechanismus hat NMD im Fall von Verlust eines Komplexproteins?

Answer 17

Normalfall: NMD Komplex gebildet aus Ribosom, EJC, UPF1, 2, 3A und 3B

UPF3A normalerweise Instabil ohne Bindung an UPF2 und schwach NMD aktiv

Fall: Verlust von UPF 3B oder 3X: Mehr Bindung von UPF3A; starker Anstieg in UPF3A Konzentration -> partiale aber schwache Rettung von NMD

UPF3B mutations can cause intellectual disability, autism or schizophrenia in humans

Question 18

Wie viele Erbkrankheiten werden durch PTC verursachende Mutationen ausgelöst?

Answer 18

ca. 1/3

Question 19

Wie kann NMD Erbkrankheiten beeinflussen?

Answer 19

Positiv: Eliminierung von C-Terminal verkürztem, dadurch dominant negativem Protein

Negativ: Eliminierung von verkürzten Proteinen, welche anderweiltig ihre Funktion noch teilweise ausführen hätten können.

Question 20

Was sagt die Position des PTC über die Erkrankung aus?

Answer 20

erste zwei Exons minus 55 nt in 3’ exon 2: relativ häufiges Vorkommen, Heterozygoten nicht betroffen, rezessive Vererbung

Letztes Exon: Selten, Heterozygoten betroffen, dominante Vererbung

Question 21

Nenne zwei Beispiele für Erkrankungen, in welchen NMD eine positive Auswirkung hat

Answer 21

β−Thalassemie
Marfan-Syndrom

Question 22

Nenne zwei Beispiele für Erkrankungen, in welchen NMD eine positive Auswirkung hat

Answer 22

Zystische Fibrose
Duchenne Muskeldystrophie

Question 23

Nenne fünf Therapieansätze zur Inaktivierung von NMD, z.B. bei Duchenne

Answer 23

*Aminoglycoside
*PTC124
*Suppressor tRNA
*Antisense oligonucleotide
*Inhibitors of NMD

Question 24

Wie wirken Aminoglykoside?

Answer 24

Bindung an 16S rRNA, Konformationsänderung von Ribosom. Erlaubt read through an PTC

Question 25

Nenne sechs Gründe für eine Varianz in dem Effekt von Aminoglykosiden als Medikament

Answer 25

1. Identity of the PTC and its sequence context.
2. Chemical composition of the aminoglycoside.
3. Variability in the aminoglycoside metabolism.
4. Duration of the treatment.
5. Method of application.
6. Difference between species (mouse vs. human).

Question 26

Wie wirkt PTC24?

Answer 26

Read Through, anderer Mechanismus als Aminoglykoside

Question 27

Wie wirkt Supressor tRNA auf NMD?

Answer 27

tRNA verändert: Erkennt Stopcodon und inseriert Aminosäure. Translation läuft über Stopcodon, kein NMD

Question 28

Wie wirken Antisense Oligonukleotide tRNA auf NMD?

Answer 28

Blockierung von Splice Site durch AOs verhindert Einbau von PTC durch Exon Skip