Gentherapie Flashcards
Vorlesung 9
Definiere Gentherapie
Einbringen von Erbsubstanz in einen Organismus zu
therapeutischen Zwecken
Was ist der Unterschied zwischen Gentherapie in somatischen- und in Keimzellen?
Gentherapie in somatischen Zellen ist nicht vererbbar
Keimbahnveränderrung bei Menschen Illegal
Nenne drei Methoden des Gentransfers plus Beispiele
- Transfektion (chemisch)
z.B. Calziumphosphat
Liposomen - Transfektion (physikalisch)
z.B. „gene gun“/Partikel
Elektroporation, Magnetofektion - Transduktion
gentechnisch veränderte Viren
Nenne sieben Methoden des Gentransfers in vitro, sowie deren Effizienz ((-3)-3 exclusive 0)
Chemische Tf. 2
Liposomen 2
Physikalische M. +/-1 (je nach methode)
Retroviren 3
Adenoviren 3
Herpesviren 3
Adenoass. Viren 3
Nenne sieben Methoden des Gentransfers in vivo, sowie deren Effizienz ((-3)-3 exclusive 0)
Chemische Tf. -1
Liposomen 1
Physikalische M. +/-1 (je nach methode)
Retroviren 1
Adenoviren 3
Herpesviren 1
Adenoass. Viren 1 (3 mit neuen gentechnisch veränderten Viren)
Nenne Vor-und Nachteile von DNA-Viren als Gentherapievektoren
Vorteile:
- Genom liegt bereits als DNA vor
- großes Fassungsvermögen
Nachteile:
- hohe Wirtszell-spezifität bei Infektion (AAV höhere Spez.)
Nenne Vor-und Nachteile von RNA-Viren als Gentherapievektoren
Vorteile:
- z.T. breites Wirtszellspektrum
Nachteile:
- RNA „nur“ transient in Zelle vorhanden
- geringes Fassungsvermögen
Nenne Vor-und Nachteile von Retroviren als Gentherapievektoren
Vorteile:
- z.T. breites Wirtszellspektrum
Nachteile:
- Replikation nur in teilungsaktiven Zellen
- tumorogen
Nenne neun wesentliche Aspekte der Vektorkonstruktion
- Klonierungskapazität
- Titer
- Zelltropismus (Pseudotypisierung)
- Verpackungszellinien
- Selektionsmarker (v.a. ex vivo)
- episomal / integrativ (Stabilität)
- Promotoraktivität
- Toxizität
- Immunogenität
Nenne die Merkmale von Retrovirusvektoren und -genom
Genom: diploide einzelstrang-RNA positiver Polarität; Länge: 7-10kB
Vektor:
- müssen verpackt werden (Verpackungszellinien)
- Titer 105-107 inf. Partikel /ml
- Kapazität: max. 8 kB Fremdsequenz
- direkte gentechnische Manipulation des Vektors möglich
- breites Wirtszellspektrum
- Integration an zufälliger Stelle in das Wirtsgenom (evtl. tumorogen)
- effektive Integration in nur in teilungsaktiven Zellen
Wie wird der Retrovirusvektor konstruiert
gag-pol- sowie envelope gene werden gegen das Zielgen (GOI), sowie eine Antibiotikaresistenz zur Selektion der funktionalen Verpackungszelllinien ausgetauscht
gag-pol- sowie envelope gene werden mit in Verpackungszelllinie injiziert, aber nicht in die infektiösen Partikel mitverpackt -> Virus reproduktionsinkompetent
Nenne die MErkmale der Adenovirusvektoren und des Genoms
Genom: 36-48kb lange dsDNA
Vektor:
- müssen in trans komplementiert werden (293 Helferzellinien; E1 Gen)
- Titer bis 1012 inf. Partikel/ml
- Kapazität: max. 35 kB Fremdsequenz (abh. von Del. im Genom)
- keine direkte gentechnische Manipulation des Vektors möglich
- hohe Wirtszellspezifität
- keine Integration in das Wirtsgenom (episomal)
- effektive Replikation unabhängig von Teilungsaktivität der Zellen
Beschreibe zwei Strategien zur Manipulation großer viraler Gene
homologe Rekombination:
- Zielgen flankiert von viraler Sequenz in Plasmid
- Kotransfektion von Genom und Plasmid in Zelle
- Rekombination, Selektion
Bacterial Artificial Chromosome:
- künstliches bakterielles Chromosom
- abgeleitet von F-Plasmid (single copy)
- bis 300 kB Insert z.B. vollständiges Virusgenom
- sehr stabil
- Manipulation möglich über „Recombineering“ mittels RecE/RecT des Rac-Prophagen oder red-System (Redα,-β, -γ) des Bakteriophagen l
Nenne sieben Merkmale von AAV (Adenoassoziierten Viren)
- 80-90% der Erwachsenen sind seropositiv für AAV2
- große Zahl von Serotypen bekannt
- über Serotyp kann Tropismus gesteuert werden; z.T. auch über
Mutagenese- und Selektionsansätze - Replikation in Wirtszellen abhängig von Adenovirus-Koinfektion
- ohne Helfervirus erfolgt nach Infektion Genomintegration
im Chromosom 19 (19q13.3-qter) - ohne Rep-Gen-Expression unterbleibt Integration (also bei AAV Vektoren)
- Genom bleibt episomal erhalten (Mechanismus noch unklar)
ist das AAV nachgewiesen Krankheitsauslösend?
Nein
Was ist die Kodierungskapazität von AAV und wie komt diese Kapazität zustande?
kleines einzelstrang-DNA Genom mit 4,7 kB Länge,daher geringe Kodierungskapazität von max. 4,7 kB
Wie werden AAV-Vektoren hergestellt?
In Vivo durch Koinfektion von Wirtszelle mit rAAV-Vektorgen, AAV Rep und Cap genen (welche nicht mitverpackt werden), sowie Virushelferproteinen E1A, E2A, E4 und VA-RNA (lncRNA)
Nenne die Besonderheit des rAAV-Vektors
Vektor enthält zwei Inverted Terminal Repeats (ITR) an den Enden, zwischen welchen das Fremdgen eincodiert wird
Nenne drei Beispiele für Gewebe mit spezifischen Promotoren, sowie jeweils mindestens ein Beispiel für gewebespez. Promotoren
Leber (Albumin)
Muskel (Myosin Light Chain 1)
Tumor (Tyrosinkinase (B16 Melanom); DF3/MUC1 (Brustkrebs); Afetoprotein (Hepatom))
Wo kann Gentherapie angewendet werden?
genetisch bedingte Erkrankungen
Onkologie
Infektionskrankheiten (z.B. AIDS)
Was sind die allgemeinen Vorraussetzungen für das in Erwägung ziehen einer gentherapeutische Behandlung?
schwere Erkrankung; ungünstige Prognose; keine verfügbare konventionelle Therapie
Was sind die Vorraussetzungen für den Einsatz von Gentherapie bei genetisch bedingten Erkrankungen?
- einzelnes Gen ist defekt (monogener Defekt)
- rezessiver Defekt
- Gen liegt in klonierter Form vor
Nenne fünf Ausschlusskriterien für den Einsatz von Gentherapie bei genetisch bedingten Erkrankungen
-zusätzliche Chromosomen z.B. Trisomie 21
- Verlust von Chromosomen z.B. Turner Syn.
- Translokation von Chromosomen
z.B. chronisch myloische Leukämie
- Deletion von Chromosomenabschnitt
z.B. Prader-Willi-Syndrom
- polygene Krankheiten
z.B. Adipositas Hypertonus, Tumore (?), Rheuma
Nenne fünf Beispiele für genetisch bedingte Erkrankungen
- familiäre Hypercholesterinämie
- FaktorVIII Mangel
- Mukoviszidose oder zystische Fibrose
- ADA-SCID
- severe combined immundeficiency syndrome
(X linked-SCID)
