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Molekularbilolgie 2024/25 > Gentherapie > Flashcards

Gentherapie Flashcards

Vorlesung 9

1
Q

Definiere Gentherapie

A

Einbringen von Erbsubstanz in einen Organismus zu
therapeutischen Zwecken

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Q

Was ist der Unterschied zwischen Gentherapie in somatischen- und in Keimzellen?

A

Gentherapie in somatischen Zellen ist nicht vererbbar

Keimbahnveränderrung bei Menschen Illegal

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3
Q

Nenne drei Methoden des Gentransfers plus Beispiele

A
  • Transfektion (chemisch)
    z.B. Calziumphosphat
    Liposomen
  • Transfektion (physikalisch)
    z.B. „gene gun“/Partikel
    Elektroporation, Magnetofektion
  • Transduktion
    gentechnisch veränderte Viren
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4
Q

Nenne sieben Methoden des Gentransfers in vitro, sowie deren Effizienz ((-3)-3 exclusive 0)

A

Chemische Tf. 2
Liposomen 2
Physikalische M. +/-1 (je nach methode)
Retroviren 3
Adenoviren 3
Herpesviren 3
Adenoass. Viren 3

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5
Q

Nenne sieben Methoden des Gentransfers in vivo, sowie deren Effizienz ((-3)-3 exclusive 0)

A

Chemische Tf. -1
Liposomen 1
Physikalische M. +/-1 (je nach methode)
Retroviren 1
Adenoviren 3
Herpesviren 1
Adenoass. Viren 1 (3 mit neuen gentechnisch veränderten Viren)

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6
Q

Nenne Vor-und Nachteile von DNA-Viren als Gentherapievektoren

A

Vorteile:
- Genom liegt bereits als DNA vor
- großes Fassungsvermögen

Nachteile:
- hohe Wirtszell-spezifität bei Infektion (AAV höhere Spez.)

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7
Q

Nenne Vor-und Nachteile von RNA-Viren als Gentherapievektoren

A

Vorteile:
- z.T. breites Wirtszellspektrum

Nachteile:
- RNA „nur“ transient in Zelle vorhanden
- geringes Fassungsvermögen

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8
Q

Nenne Vor-und Nachteile von Retroviren als Gentherapievektoren

A

Vorteile:
- z.T. breites Wirtszellspektrum

Nachteile:
- Replikation nur in teilungsaktiven Zellen
- tumorogen

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9
Q

Nenne neun wesentliche Aspekte der Vektorkonstruktion

A
  • Klonierungskapazität
  • Titer
    -Zelltropismus (Pseudotypisierung)
  • Verpackungszellinien
  • Selektionsmarker (v.a. ex vivo)
  • episomal / integrativ (Stabilität)
  • Promotoraktivität
  • Toxizität
  • Immunogenität
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10
Q

Nenne die Merkmale von Retrovirusvektoren und -genom

A

Genom: diploide einzelstrang-RNA positiver Polarität; Länge: 7-10kB

Vektor:
- müssen verpackt werden (Verpackungszellinien)
- Titer 105-107 inf. Partikel /ml
- Kapazität: max. 8 kB Fremdsequenz
- direkte gentechnische Manipulation des Vektors möglich
- breites Wirtszellspektrum
- Integration an zufälliger Stelle in das Wirtsgenom (evtl. tumorogen)
- effektive Integration in nur in teilungsaktiven Zellen

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11
Q

Wie wird der Retrovirusvektor konstruiert

A

gag-pol- sowie envelope gene werden gegen das Zielgen (GOI), sowie eine Antibiotikaresistenz zur Selektion der funktionalen Verpackungszelllinien ausgetauscht

gag-pol- sowie envelope gene werden mit in Verpackungszelllinie injiziert, aber nicht in die infektiösen Partikel mitverpackt -> Virus reproduktionsinkompetent

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12
Q

Nenne die MErkmale der Adenovirusvektoren und des Genoms

A

Genom: 36-48kb lange dsDNA

Vektor:
- müssen in trans komplementiert werden (293 Helferzellinien; E1 Gen)
- Titer bis 1012 inf. Partikel/ml
- Kapazität: max. 35 kB Fremdsequenz (abh. von Del. im Genom)
- keine direkte gentechnische Manipulation des Vektors möglich
- hohe Wirtszellspezifität
- keine Integration in das Wirtsgenom (episomal)
- effektive Replikation unabhängig von Teilungsaktivität der Zellen

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13
Q

Beschreibe zwei Strategien zur Manipulation großer viraler Gene

A

homologe Rekombination:
- Zielgen flankiert von viraler Sequenz in Plasmid
- Kotransfektion von Genom und Plasmid in Zelle
- Rekombination, Selektion
Bacterial Artificial Chromosome:
- künstliches bakterielles Chromosom
- abgeleitet von F-Plasmid (single copy)
- bis 300 kB Insert z.B. vollständiges Virusgenom
- sehr stabil
- Manipulation möglich über „Recombineering“ mittels RecE/RecT des Rac-Prophagen oder red-System (Redα,-β, -γ) des Bakteriophagen l

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14
Q

Nenne sieben Merkmale von AAV (Adenoassoziierten Viren)

A
  • 80-90% der Erwachsenen sind seropositiv für AAV2
  • große Zahl von Serotypen bekannt
  • über Serotyp kann Tropismus gesteuert werden; z.T. auch über
    Mutagenese- und Selektionsansätze
  • Replikation in Wirtszellen abhängig von Adenovirus-Koinfektion
  • ohne Helfervirus erfolgt nach Infektion Genomintegration
    im Chromosom 19 (19q13.3-qter)
  • ohne Rep-Gen-Expression unterbleibt Integration (also bei AAV Vektoren)
  • Genom bleibt episomal erhalten (Mechanismus noch unklar)
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15
Q

ist das AAV nachgewiesen Krankheitsauslösend?

A

Nein

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16
Q

Was ist die Kodierungskapazität von AAV und wie komt diese Kapazität zustande?

A

kleines einzelstrang-DNA Genom mit 4,7 kB Länge,daher geringe Kodierungskapazität von max. 4,7 kB

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17
Q

Wie werden AAV-Vektoren hergestellt?

A

In Vivo durch Koinfektion von Wirtszelle mit rAAV-Vektorgen, AAV Rep und Cap genen (welche nicht mitverpackt werden), sowie Virushelferproteinen E1A, E2A, E4 und VA-RNA (lncRNA)

18
Q

Nenne die Besonderheit des rAAV-Vektors

A

Vektor enthält zwei Inverted Terminal Repeats (ITR) an den Enden, zwischen welchen das Fremdgen eincodiert wird

19
Q

Nenne drei Beispiele für Gewebe mit spezifischen Promotoren, sowie jeweils mindestens ein Beispiel für gewebespez. Promotoren

A

Leber (Albumin)

Muskel (Myosin Light Chain 1)

Tumor (Tyrosinkinase (B16 Melanom); DF3/MUC1 (Brustkrebs); Afetoprotein (Hepatom))

20
Q

Wo kann Gentherapie angewendet werden?

A

genetisch bedingte Erkrankungen

Onkologie

Infektionskrankheiten (z.B. AIDS)

21
Q

Was sind die allgemeinen Vorraussetzungen für eine gentherapeutische Behandlung?

A

schwere Erkrankung; ungünstige Prognose; keine verfügbare konventionelle Therapie

22
Q

Was sind die Vorraussetzungen für den Einsatz von Gentherapie bei genetisch bedingten Erkrankungen?

A
  • einzelnes Gen ist defekt (monogener Defekt)
  • rezessiver Defekt
  • Gen liegt in klonierter Form vor
23
Q

Nenne fünf Ausschlusskriterien für den Einsatz von Gentherapie bei genetisch bedingten Erkrankungen

A

-zusätzliche Chromosomen z.B. Trisomie 21
- Verlust von Chromosomen z.B. Turner Syn.
- Translokation von Chromosomen
z.B. chronisch myloische Leukämie
- Deletion von Chromosomenabschnitt
z.B. Prader-Willi-Syndrom
- polygene Krankheiten
z.B. Adipositas Hypertonus, Tumore (?), Rheuma

24
Q

Nenne fünf Beispiele für genetisch bedingte Erkrankungen

A
  • familiäre Hypercholesterinämie
  • FaktorVIII Mangel
  • Mukoviszidose oder zystische Fibrose
  • ADA-SCID
  • severe combined immundeficiency syndrome
    (X linked-SCID)
25
Q

Nenne die Merkmale der familiären Hypercholesterinämie sowie deren Ursache

A

-Extrem hoher Cholesterinspiegel
-Arteriosklerose
-Herzinfarkt oft bereits im Alter von 20 Jahren

Ursache: Fehlen von LDL-Rezeptor -> gestöhrte Cholesterinaufnahme in Leber

26
Q

Wie kann familiäre Hypercholesterinämie behandelt werden?

A

in Vitro Gentherapie:

-Leberbiopsie -> Entfernung von Hepatozyten

-Einbringen von LDL-Rezeptorgen via Retrovirusvektor

-Kultivierung von GMO-Hepatozyten

-Infusion der GMO-Hepatozyten in Patientenleber

27
Q

Was ist Faktor VIII und welche Auswirkung hat die Abwesenheit? Was ist der Standardgentherapieansatz?

A

Enzym (Protease) in der Blutgerinnungskaskade
Gen hat 186 kb (26 Exons); 9 kb cDNA

Folge: Hämophilie A

Therapieansatz: Einbringen von funktionellem Gen

28
Q

Definiere Mukoviszidose/zystische Fibrose. Was ist der Standardgentherapieansatz?

A
  • Defekt im Cystic Fibrosis-Transmembrane Regulator Protein
  • Ionenkanaldefekt in Zellmembran der Schleimhautzellen
    der Lunge
  • lebensbedrohliche Verschleimung der Lunge; Schleim wird
    nicht ausgehustet weil Wasser durch Kanaldefekt fehlt

Therapieansatz: Einbringen von funktionellem Gen

29
Q

Wie wird Mukoviszidose per Gentherapie behandelt?

A

In Vivo Gentherapie: Inhalation von AAV-Vektoren mit funktionalem Cystic Fibrosis-Transmembrane Regulator Gen

30
Q

Was ist ADA-SCID?

A
  • Adenosin-Desaminase Defekt
  • Adenosin und 2´-Deoxyadenosin akkumulieren in allen Körperzellen; v.a. für unreife lymphoide Zellen toxisch
  • Dysfunktion B-und T-Zellen; daher verminderte zelluläre
    und humorale Immunantwort
31
Q

Welche Methoden zum Gentransfer werden für Virusvektoren verwendet?

A
  • intravenöse Injektion (systemisch)
  • intraoperative Applikation in Tumorhöhle (lokal)
  • Inhalation
32
Q

Was muss bei der Gentherapie besonders beachtet werden?

A

Tropismus des Vektors und Gewebsspezifität des Promotors

33
Q

Nenne zwei schwere Risiken der Gentherapie

A
  • immunantwort gegen Vektor (bei geringer Anzahl infektiöser Partikel: Therapie Erfolglos. Bei hoher Anzahl infektiöser Partikel (Normalfall bei Gentherapie): Blutgerinnung und Organversagen als Folge der Aktivierung des Komplementsystems durch z.B. Adenovirusantikörper)
  • Bei DNA-Integration (retrovirusvektor z.B. bei ADA-SCID-Behandlung): Tumorogenität durch zufällige Insertposition
34
Q

Nenne drei Merkmale von CAR-T-Zellen

A
  • Haben einen synthetischen Rezeptor mit einer Antigen-bindenden
    Domäne aus einem Antikörper, der an eine vom nativen T-Zell-
    Rezeptor abgeleitete signalübertragende Endodomäne gekoppelt ist
  • Chimäre Antigenrezeptoren (CARs) haben somit die Spezifität
    eines Antikörpers, der an die zytotoxischen Effektormechanismen derT-Zelle gekoppelt ist.
  • Werden normalerweise ex vivo (im Labor) erzeugt, aber jetzt
    werden auch Versuche entwickelt, sie in vivo (im Körper) zu
    erzeugen
35
Q

Beschreibe die CAR-T-Zellmethode zur Tumorbekämpfung

A

Extraktion von Autologen, peripheralen T-Zellen

Modifikation der T-Zellen; Addition von Tumo-spezifischem T-Zellrezeptor

Klonierung der modifizierten T-Zellen

Injektion in Patient; Tumorsuppression

36
Q

Stammzelltherapie kann als Ersatz für Gentherapie verwendet werden. Was ist ein größeres Risiko dabei?

A
  • Pluripotente Stammzellen bilden in Therapieeinsatz Tumore
  • Dürfen nicht als Verunreinigung mit appliziert werden
37
Q

Was ist genome editing? Worin liegt der Unterschied zum Gentransfer?

A

Editierung des Genoms mittels CRISPR/Cas.

Benötigt keinen Gentransfervektor

38
Q

Nenne drei Methoden zur Behandlung von sickle cell disease via gentherapie

A
  • Inaktivierung von gamma-globin inhibitorgen via CRISPR/Cas

-Einbringen von korrektem Gen mittels Lentivirus

  • Austausch von mutiertem Gen gegen korrektes Gen aus Donorstrang mittels CRISPR/Cas
39
Q

Beschreibe die Unterschiede zwischen genome- und prime editing (neuere Alternative zu genome editing)

A

Alte Version:
- Doppelstrangschnitt durch Cas9
- Bereitstellung von dsDNA mit korrekter Sequenz
- Einbau korrekter Sequenz durch DS Bruch-repair System der Zelle (ineffizient)

Neue Version:
- „search and replace“ Technik
- Cas9 Mutante die nur einen DNA Strangschneiden kann (Nickase)
- Bereitstellung von langer guide RNA mitkorrekter Template-Sequenz
- Cas9 ist fusioniert an Reverse Transcriptase (RT)

40
Q
A

Molekularbilolgie 2024/25 (13 decks)

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