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Molekularbilolgie 2024/25 > RNA-Interferenz in Eukaryoten > Flashcards

RNA-Interferenz in Eukaryoten Flashcards

Vorlesung 8

1
Q

Was ist der Unterschied zwischen der Interferenz durch siRNA und miRNA?

A

siRNA+zelleigener Proteinkomplex spaltet target mRNA

miRNA+zelleigener Proteinkomplex inhibiert Translation

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2
Q

Beschreibe das Experiment (plus Ergebnisse) in C.Elegans, welches die Notwendigkeit von dsRNA zur Inhibition aufzeigt.

A
  • Injektion von sense-, antisense-, und dsRNA zu Unc22 in C.Elegans.
  • Bei Injektion von sense- und antisense RNA: keine Ergebnisse. Bei dsRNA: unkontrollierte Muskelzuckungen (zurückzuführen auf Inhibition von Unc22)
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3
Q

Welche Aufgabe hat mex-3 normalerweise und welche Auswirkung hatte die Injektion von mex-3 dsRNA?

A
  • Expremiert in Gonaden und Embryonen dient mex-3 der Aufrechterhaltung der Totipotenz in Keimzellen und Entscheidung des Zellschicksals im Embryo
  • dsRNA Injektion: kompletter Verlust der natürlichen mex-3 mRNA; potente und spezifische Interferenz targetierter mRNA
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4
Q

Bleibt das dsRNA Silencing auf die injizierten Zellen beschränkt?

A

Nein, Ausbreitung in Geweben ist nachgewiesen

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5
Q

ISt das dsRNA vermittelte Silencing vererbbar?

A

Ja

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6
Q

kann dsRNA gegen pre-processing mRNA (mRNA+introns und Promotor) gerichtet sein?

A

Nein, nur gegen reife mRNA

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7
Q

ist eine große Menge an dsRNA für Interferenz notwendig? Was sagt die Antwort aus?

A

Nein, wenige Moleküle Ausreichend.

Hinweis auf Amplifikationsschritt oder katalytische Aktivität

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8
Q

Wo wurde dsRNA silencing nachgewiesen?

A

Pilze (Quelling)

Pflanzen (Co-Suppression)

Zebrafische

Fruchtfliegen

Nematoden

Säuger

Ausnahmen z.B. Saccharomes cerevisiae

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9
Q

Wie hebt sich die dsRNA Suppression in Säugern von der Suppression in anderen Eukaryoten ab?

A

lange dsRNA führt zu unkontrollierter Immunantwort, nicht suppression

kurze dsRNA wird tolleriert, führt aber nicht zu permanentem, sondern transientem gen-silencing. Sehr effizient dennoch.

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10
Q

Beschreibe den grundlegenden Mechanismus der RNA-Interferenz (5 Schritte)

A

-Spaltung von langer dsRNA in kurze (~20-25 nt) siRNA durch Dicer-Protein (dsRNA-Prozessierung)

-Bildung des RISC-Komplexes: Übergabe von siRNA durch Dicer +dsRBP (dsRNA bindendes Protein) an Argonaut-Protein (AGO)

-Auswahl des Guide-Stranges: Abspaltung von Passenger (sense) Strang und Entfernung dessen aus RISC-Komplex

-Target-mRNA Erkennung und Spaltung: Bindung von Guide-Strang an target mRNA (komplementäre Basenpaarung); Endonukleolytische Spaltung von Target durch AGO

-RISC-Recycling: Entfernung von gespaltener mRNA aus RISC; Weitere Bindung von RISC an Target-mRNA via guide-strang möglich

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11
Q

Nenne fünf Merkmale des Dicer Proteins

A

Größe: ca.200kDa

Multidomänenprotein (Helicase, DUF, Platform, Ruler, RNAse IIIa und b, dsRBD)

L-Förmige Tertiärstruktur

Endoribonuklease aus RNAse III-Familie

Funktion: Spaltung von dsRNA in ca. 20-25 nt lange siRNA

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12
Q

Wie groß ist das AGO-Protein?

A

~100 kDa

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13
Q

Wie heißt die aktive Domäne von AGO?

A

PIWI-Domäne

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14
Q

was ist die katalytische Komponente von AGO?

A

RNase H-ähnliche Faltung mit katalytischer Tetrade (AspGluAspHis)

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15
Q

Welche Bestandteile enthält der RISC-Komplex?

A

mindestens guide RNA und AGO, weitere Proteine möglich. Normalerweise großer Ribonukleoproteinkomplex

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16
Q

Nenne vier Merkmale von siRNA-Molekülen

A

kurze dsRNA

3’ Enden: Hydroxylgruppe + 2 nt Überhang

5’-Enden: Monophosphatgruppe

Spaltstelle der Target mRNA: zwischen nt 10 und 11 von 5’-Ende

17
Q

Wie viele AGO-Proteine und Dicer kommen in C. Elegans vor?

A

27 AGO-Proteine (RDE1: Interaktion mit primären siRNAs WAGOs: Interaktion mit sekundären siRNAs), 1 Dicer

18
Q

Wie viele AGO-Proteine und Dicer kommen in Arabidopsis thalania vor?

A
  • 10 Argonauten-Proteine; Slicer-Aktivität in 5 AGOs
  • 4 Dicer (Dicer-like)
    »DCL1 = miRNA Biogenese
    (PTGS)
    »DCL2 = Produktion viraler
    siRNAs (PTGS)
    »DCL3 = Heterochromatin-
    Stilllegung (TGS)
19
Q

Wie viele AGO-Proteine und Dicer kommen in Homo Sapiens vor?

A
  • 4 Argonauten-Proteine (PTGS)
    » Slicer-Aktivität nur in Ago2
  • 1 Dicer
20
Q

Nenne vier Funktionen von RNA-Interferenz

A

in Pflanzen, Würmern und Insekten: Schutz vor Pathogenen (z.B. Pilze, Viren, Bakterien)

Aufrechterhaltung der Genomstabilität durch silencing mobiler Genomelemente (transposons)

RNAi-ähnlicher Mechanismus übt transkriptionelles gene silencing
aus, führt zur Modulation von Chromatin und kann vererbt werden

RNAi-ähnlicher Mechanismus (miRNA) reguliert Expression vieler GEne in Säugern

21
Q

Nenne drei Anwendungsmöglichkeiten von siRNA-mediated RNA-Interferenz

A

Gezielte Untersuchung spezifischer Gene (siRNA mediated Knockdowns)

therapeutische Anwendung

Bekämpfung von Pflanzenschädlingen

22
Q

welche Art von Polymerase ist für Virusabwehr mittels RNAi notwendig?

A

RNA-abhängige RNA Polymerase (RdRP)

23
Q

Wozu ist RdRP in der viralen RNAi notwendig?

A

Synthese von antrisense strang zu viraler RNA -> Generierung von dsRNA als Vorstufe zu siRNA

24
Q

Nenne zwei Merkmale von RdRP, abgesehen von der Fumktion

A
  • existieren in C. elegans, Pflanzenund Pilzen
  • katalytische Domäne entfernt verwandtmit DNA-abhängigen RNA Polymerasen
25
Q

antivirale RNAi in C.Elegans Teil eins: Beschreibe den Aufbau primärer siRNA, sowie die drei Schritte der antivirale RNAi, welche primäre siRNA involvieren

A
  • Dicer-Produkte mit 5‘-Monophosphatgruppe und 2 nts-3‘-Überhängen
  • Assoziieren mit primary AGO (RDE-1)
  • Der Komplex bestehend aus siRNA-RDE-1 bindet an Target-RNA
  • Rekrutierung der RdRP RRF1
26
Q

antivirale RNAi in C.Elegans Teil zwei: Beschreibe die Besonderheiten sekundärer siRNA, sowie die Schritte der antivirale RNAi, welche primäre siRNA involvieren

A
  • De novo Synthese durch die RdRP RRF-1
  • Entstehen upstream der primären siRNA
  • Antisense in Bezug auf Target-RNA
  • Tragen 5‘-Triphosphatgruppe
  • Primer-unabhängige Synthese
  • Hoher Level an sek. siRNAs
  • Targetieren einen größeren Sequenzbereich der Target-RNA
  • Assoziieren mit WAGO
  • Spaltung der viralen RNA
27
Q

Nenne die drei Mechanismen der RNAI in Pflanzen, sowie deren Einsatzpunkte

A
  1. Gene silencing durch exogene RNA-Trigger
    - Virusabwehr, RdRP-vermittelte Amplifikation von sekundären siRNAs
  2. Gene silencing endogener mRNAs durch miRNAs
    - Regulation der Genexpression durch Inhibition der Translation oder RNA-Degradation
  3. Transcriptional gene silencing (TGS)
    - DNA-Methylierung und Histonmodifikation, Transkriptionshemmung

Molekularbilolgie 2024/25 (10 decks)

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