RNA-Interferenz in Eukaryoten

Question 1

Was ist der Unterschied zwischen der Interferenz durch siRNA und miRNA?

Answer 1

siRNA+zelleigener Proteinkomplex spaltet target mRNA

miRNA+zelleigener Proteinkomplex inhibiert Translation

Question 2

Beschreibe das Experiment (plus Ergebnisse) in C.Elegans, welches die Notwendigkeit von dsRNA zur Inhibition aufzeigt.

Answer 2

• Injektion von sense-, antisense-, und dsRNA zu Unc22 in C.Elegans.
• Bei Injektion von sense- und antisense RNA: keine Ergebnisse. Bei dsRNA: unkontrollierte Muskelzuckungen (zurückzuführen auf Inhibition von Unc22)

Question 3

Welche Aufgabe hat mex-3 normalerweise und welche Auswirkung hatte die Injektion von mex-3 dsRNA?

Answer 3

• Expremiert in Gonaden und Embryonen dient mex-3 der Aufrechterhaltung der Totipotenz in Keimzellen und Entscheidung des Zellschicksals im Embryo
• dsRNA Injektion: kompletter Verlust der natürlichen mex-3 mRNA; potente und spezifische Interferenz targetierter mRNA

Question 4

Bleibt das dsRNA Silencing auf die injizierten Zellen beschränkt?

Answer 4

Nein, Ausbreitung in Geweben ist nachgewiesen

Question 5

ISt das dsRNA vermittelte Silencing vererbbar?

Answer 5

Ja

Question 6

kann dsRNA gegen pre-processing mRNA (mRNA+introns und Promotor) gerichtet sein?

Answer 6

Nein, nur gegen reife mRNA

Question 7

ist eine große Menge an dsRNA für Interferenz notwendig? Was sagt die Antwort aus?

Answer 7

Nein, wenige Moleküle Ausreichend.

Hinweis auf Amplifikationsschritt oder katalytische Aktivität

Question 8

Wo wurde dsRNA silencing nachgewiesen?

Answer 8

Pilze (Quelling)

Pflanzen (Co-Suppression)

Zebrafische

Fruchtfliegen

Nematoden

Säuger

Ausnahmen z.B. Saccharomes cerevisiae

Question 9

Wie hebt sich die dsRNA Suppression in Säugern von der Suppression in anderen Eukaryoten ab?

Answer 9

lange dsRNA führt zu unkontrollierter Immunantwort, nicht suppression

kurze dsRNA wird tolleriert, führt aber nicht zu permanentem, sondern transientem gen-silencing. Sehr effizient dennoch.

Question 10

Beschreibe den grundlegenden Mechanismus der RNA-Interferenz (5 Schritte)

Answer 10

-Spaltung von langer dsRNA in kurze (~20-25 nt) siRNA durch Dicer-Protein (dsRNA-Prozessierung)

-Bildung des RISC-Komplexes: Übergabe von siRNA durch Dicer +dsRBP (dsRNA bindendes Protein) an Argonaut-Protein (AGO)

-Auswahl des Guide-Stranges: Abspaltung von Passenger (sense) Strang und Entfernung dessen aus RISC-Komplex

-Target-mRNA Erkennung und Spaltung: Bindung von Guide-Strang an target mRNA (komplementäre Basenpaarung); Endonukleolytische Spaltung von Target durch AGO

-RISC-Recycling: Entfernung von gespaltener mRNA aus RISC; Weitere Bindung von RISC an Target-mRNA via guide-strang möglich

Question 11

Nenne fünf Merkmale des Dicer Proteins

Answer 11

Größe: ca.200kDa

Multidomänenprotein (Helicase, DUF, Platform, Ruler, RNAse IIIa und b, dsRBD)

L-Förmige Tertiärstruktur

Endoribonuklease aus RNAse III-Familie

Funktion: Spaltung von dsRNA in ca. 20-25 nt lange siRNA

Question 12

Wie groß ist das AGO-Protein?

Answer 12

~100 kDa

Question 13

Wie heißt die aktive Domäne von AGO?

Answer 13

PIWI-Domäne

Question 14

was ist die katalytische Komponente von AGO?

Answer 14

RNase H-ähnliche Faltung mit katalytischer Tetrade (AspGluAspHis)

Question 15

Welche Bestandteile enthält der RISC-Komplex?

Answer 15

mindestens guide RNA und AGO, weitere Proteine möglich. Normalerweise großer Ribonukleoproteinkomplex

Question 16

Nenne vier Merkmale von siRNA-Molekülen

Answer 16

kurze dsRNA

3’ Enden: Hydroxylgruppe + 2 nt Überhang

5’-Enden: Monophosphatgruppe

Spaltstelle der Target mRNA: zwischen nt 10 und 11 von 5’-Ende

Question 17

Wie viele AGO-Proteine und Dicer kommen in C. Elegans vor?

Answer 17

27 AGO-Proteine (RDE1: Interaktion mit primären siRNAs WAGOs: Interaktion mit sekundären siRNAs), 1 Dicer

Question 18

Wie viele AGO-Proteine und Dicer kommen in Arabidopsis thalania vor?

Answer 18

• 10 Argonauten-Proteine; Slicer-Aktivität in 5 AGOs
• 4 Dicer (Dicer-like)
  »DCL1 = miRNA Biogenese
  (PTGS)
  »DCL2 = Produktion viraler
  siRNAs (PTGS)
  »DCL3 = Heterochromatin-
  Stilllegung (TGS)

Question 19

Wie viele AGO-Proteine und Dicer kommen in Homo Sapiens vor?

Answer 19

• 4 Argonauten-Proteine (PTGS)
  » Slicer-Aktivität nur in Ago2
• 1 Dicer

Question 20

Nenne vier Funktionen von RNA-Interferenz

Answer 20

in Pflanzen, Würmern und Insekten: Schutz vor Pathogenen (z.B. Pilze, Viren, Bakterien)

Aufrechterhaltung der Genomstabilität durch silencing mobiler Genomelemente (transposons)

RNAi-ähnlicher Mechanismus übt transkriptionelles gene silencing aus, führt zur Modulation von Chromatin und kann vererbt werden

RNAi-ähnlicher Mechanismus (miRNA) reguliert Expression vieler GEne in Säugern

Question 21

Nenne drei Anwendungsmöglichkeiten von siRNA-mediated RNA-Interferenz

Answer 21

Gezielte Untersuchung spezifischer Gene (siRNA mediated Knockdowns)

therapeutische Anwendung

Bekämpfung von Pflanzenschädlingen

Question 22

welche Art von Polymerase ist für Virusabwehr mittels RNAi notwendig?

Answer 22

RNA-abhängige RNA Polymerase (RdRP)

Question 23

Wozu ist RdRP in der viralen RNAi notwendig?

Answer 23

Synthese von antrisense strang zu viraler RNA -> Generierung von dsRNA als Vorstufe zu siRNA

Question 24

Nenne zwei Merkmale von RdRP, abgesehen von der Fumktion

Answer 24

• existieren in C. elegans, Pflanzenund Pilzen
• katalytische Domäne entfernt verwandtmit DNA-abhängigen RNA Polymerasen

Question 25

antivirale RNAi in C.Elegans Teil eins: Beschreibe den Aufbau primärer siRNA, sowie die drei Schritte der antivirale RNAi, welche primäre siRNA involvieren

Answer 25

* Dicer-Produkte mit 5‘-Monophosphatgruppe und 2 nts-3‘-Überhängen * Assoziieren mit primary AGO (RDE-1) * Der Komplex bestehend aus siRNA-RDE-1 bindet an Target-RNA * Rekrutierung der RdRP RRF1

Question 26

antivirale RNAi in C.Elegans Teil zwei: Beschreibe die Besonderheiten sekundärer siRNA, sowie die Schritte der antivirale RNAi, welche primäre siRNA involvieren

Answer 26

* De novo Synthese durch die RdRP RRF-1 * Entstehen upstream der primären siRNA * Antisense in Bezug auf Target-RNA * Tragen 5‘-Triphosphatgruppe * Primer-unabhängige Synthese * Hoher Level an sek. siRNAs * Targetieren einen größeren Sequenzbereich der Target-RNA * Assoziieren mit WAGO * Spaltung der viralen RNA

Question 27

Nenne die drei Mechanismen der RNAI in Pflanzen, sowie deren Einsatzpunkte

Answer 27

1. Gene silencing durch exogene RNA-Trigger - Virusabwehr, RdRP-vermittelte Amplifikation von sekundären siRNAs 2. Gene silencing endogener mRNAs durch miRNAs - Regulation der Genexpression durch Inhibition der Translation oder RNA-Degradation 3. Transcriptional gene silencing (TGS) - DNA-Methylierung und Histonmodifikation, Transkriptionshemmung