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Molekularbilolgie 2024/25 > Cloning Strategies > Flashcards

Cloning Strategies Flashcards

Vorlesung 3

1
Q

Nenne die drei Definitionen des Begriffs Klon

A
  1. Genetisch identische Nachkommen
  2. genetisch identische Zellen, welche Nachkommen einer einzigen Zelle sind
  3. Pflanzen oder Tiere mit Erbgut identisch zu ihrem Progenitor
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Q

Was sind Vektoren?

A

Modifizierte DNA, selten RNA, verwendet als Transportvehikel zum Einbringen von Fremdsequenzen in eine Wirtszelle

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3
Q

Aus welchen Organismen können die Ursprungssequenzen von Vektoren stammen?

A

Bakterien, Viren oder Hefen
Häufig bakterielle Plasmide

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4
Q

Welche Schritte sind generell vor dem Einbringen eines Vektors in eine Zielzelle notwendig?
Welche Enzyme werden benötigt?

A
  1. Isolation von Plasmid aus Bakterium
    1.5. Isolation von DNA mit Gene of Interest (GOI) aus Zellkern
  2. Enzymatische Restriktion von Plasmid, enzymatische Modifikationen
    2.5. Preparation von Target DNA (PCR, enzymatische Restriktion/modifikation)
  3. Rekombination und Ligation von Vektor und Target mittels Ligase/Topoisomerase/PCR basierten Techniken

Endergebnis: Vektor beladen mit GOI

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5
Q

Was muss beim Vorbereiten des beladenen Vektors beachtet werden?

A

Reading Frame darf nicht verschoben werden

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6
Q

Welche Schritte erfolgen generell nach Vorbereitung des beladenen Vektors?

A
  1. Einbringen von Vektor in Wirtszelle (Transformation)
  2. Multiplikation von modifizierter DNA durch Wirtszelle
  3. Selektion der Transformanten
  4. Plasmidaufreinigung, Identifikation von Klonen des rekombinanten Vektors
  5. Analyse
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7
Q

Welche Einsatzmöglichkeiten für Klonierung gibt es?

A

1.Subklonierung
1.1. Vektoraustausch
1.2. Selektion von Subfragmenten für Experimente
2. Sequenzanalysen
3. Erstellung von Gene libraries (genomic gene ( whole or partial) or complete cDNA)
4. Proteinexpression/Produktion
5. Funktionsanalyse
6. Mutageneseexperimente
7. Produktion von Knock-out,-in oder -down konstrukten in eukaryotischen Zellen (mittels CRISPR-Cas9 oder shRNA)
8. Erschaffung von genetisch modifizierten Pflanzen oder Tieren
9. Erstellung von Gentherapievektoren

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8
Q

Nenne alle Vektorfamilien (6 antworten)

A

-Phagen
-Plasmide
-Cosmide
-Bacterial Artificial Chromiosomes (BACs)
-Yeast Artificial Chromosomes (YACs)
-Virusvektoren (z.B. gamma-Retroviren oder Lentiviren)

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9
Q

Nenne die Grundmerkmale von Plasmidvektoren

A

-extrachromosomale, zirkuläre DNA moleküle
-autonome Replikation in Bakterien
-(in natürlichen Plasmiden mindestens ein) ORI
in künstlichen/Laborplasmiden
-Polylinker, aka. Multiple Cloning Site (MCS)
-Kombination von Selektionsmarkern

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10
Q

Welche Aufgaben haben natürliche Plasmide in Bakterien unter anderem?

A

Vermittlung von Resistenzgenen und Ermöglichung von DNA austausch (F-Plasmid)

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11
Q

Welche Plasmide werden für die Subklonierung von DNA verwendet?

A

pUC-Familie
Plasmidvektoren für spezielle Prozeduren, z.B. pTOPO

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12
Q

Nenne zwei Plasmide welche für die Proteinexpression genutzt werden und deren Markereigenschaft

A

pET: Expression von Fusionsproteinen mit His-Tag; Reinigung mit Metallionenchromatoghaphie (Nickel/Cobalt)

pGEX: Expression von Fusionsproteinen mit GST-Tag, Reinigung mit Gluthathionchromatographie oder GST Pull-down

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13
Q

Welche drei Phagen werden oft als Vektoren genutzt?

A

m13-, lambda-, und P1-Phagen

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14
Q

Beschreibe den lysogenen Zyklus

A

Integration von PhagenDNA in BakterienDNA, Vermehrung via bakterieller Mitose

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15
Q

Beschreibe den lytischen Zyklus

A

spontane Reaktivierung (Verlassen des Pakteriengenoms) des Phagengenoms aus lysogenem Zyklus, Aktivierung von Phagenproduktion, Phagenfreisetzung unter Lyse von Wirtsbakterium

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16
Q

Welche Merkmale hat die Phagen-DNA?

A

-lineare dsDNA
-besitzt ORI und COS-sites
-Zirkulär (Annealing von terminalen COS-Sites) in Bakterium im aktiven Zustand

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17
Q

Wie wird phagenDNA repliziert?

A

Roling Circle method:
-Einschnitt eines Stranges der zirkulären dsDNA an COS-Site
-replikation von 5’ zu 3’ des geschnittenen stranges mit ungeschnittenem Strang als Template
->Folge: Langer wiederholter DNA einzelstrang
-Ergänzung des zweiten Strangs mittels Okazaki fragmenten
->Folge: langer dsDNA strang aus template repeats (Concactamer)

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18
Q

Beschreibe das Packaging von dsDNA in Phagen

A

-Terminase TerS-Ring erkennt und bindet virale dsDNA (Concactamer)
-Virales Genom wird an erster COS-Site von Terminase geschnitten
-Terminase TerL-Ring bindet Portalring des Procapsids des Phagen
-ATP-abhängiger Transfer von dsDNA in Procapsid
-Bei Erreichen der nächsten COS-Site Stimulation der Nukleaseaktivität der Terminase, Schnitt von Concactamer an COS-Site, Dissoziation von Procapsid
-Tail-Protein bindet an Portalprotein -> mature phagen

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19
Q

was ist der limitierende Faktor für die Größe eines GOI bei Phagen?

A

Die Größe des Phagenköpfchens

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20
Q

Wie können Concactamere in vitro erzeugt werden?

A

Annealing von COS-Site

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21
Q

Welche zwei Methoden der Phagenvektoren gibt es?

A

1.Insertionsvektor (Insertion von GOI in Phagen DNA ohne Entfernung größerer DNA-Abschnitte, moderate Kapazität, geeignet für Erstellung von cDNA libraries)
2.Replacementvektor (Ersetzen größerer Abschnitte der PhagenDNA mit GOI, hohe Kapazität, geeignet für Erstellung von gene libraries)

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22
Q

Was sind Concactamere

A

DNA Multimere mit COS-Sites zwischen den Repeats

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23
Q

Was sind Cosmide?

A

Plasmide mit COS-Sites

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24
Q

Was ist der generelle Mechanismus der Cosmidklonierung nach Rekombination mit GOI?

A

in-vitro verpackung in Phagen, Infektion von Bakterien als Phagen, Cyklisierung in Bakterien ( formung von Plasmidring durch Cos-site annealing) -> Replikation als Plasmid

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25
Q

Was ist der Unterschied zwischen Phagen-und Cosmidvektoren?

A

Bakterien werden bei Cosmidvektoren nicht, wie es bei den Phagenvektoren passiert, lysiert. Rekombinante Klone sind Bakterien

Bei Phagen: Bakterien werden lysiert, rekombinante Klone sind Phagen

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26
Q

Wie hoch ist die Kapazität von Cosmidvektoren?

A

35-50kb

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27
Q

Was sind die Merkmale von YACs?

A

-lineare DNA
-Telomere
-Centromerregion
-ORI
-Prokaryotische Resistenzgene (AmpR)
-Autonomously Replicating Sequence (ARS)
-Hefespezifische Selektionsmarker
-Vermehrung durch Aufteilung auf Tochterzellen wärend Mitose

28
Q

Was ist die Kapazität von YACs?

A

~500kb, Instabil bei zu kurzen Inserts

29
Q

Was sind die Merkmale von BACs?

A

-Zirkuläre DNA (basierend auf mini-F-Plasmid)
-Enthält ORI
-Selektionsmarker
-regulatorische Sequenzen

30
Q

Kapazität von BACs?

A

~500-1000kB, limitiert durch Methode zur Wirtszellinsertion

31
Q

Was ist das entscheidende Merkmal von Retroviren?

A

Insertion von DNA in Wirtszellgenom, stabile long term expression

32
Q

Können sich die verwendeten Viren vermehren?

A

Nein

33
Q

Wie werden die replikationsdefizienten Viren hergestellt?

A

Virusgeninformation wird auf 2-3 Plasmide, das Transverplasmid (Promotor und GOI), Das Packaging- und das Hüllenplasmid aufgeteilt
Co-Transfektion von Vektor- und Verpackungs/Hüllenplasmiden in HEK 239T-Zellen;
DNA für Capsidproteine, virale Glykoproteine und viraler Replikationsmaschinerie (Packaging- und Hüllenplasmide) werden nicht verpackt. Viren sind replikationsdefizient

34
Q

Welche viralen Vektoren werden Verwendet, was ist deren Kapaztität, tragen sie DNA oder RNA, integrieren sie ihre DNA-sequenz in das Wirtsgenom?

A

gamma-Retrovirus, ~8kb, ssRNA, Ja

Lentivirus, ~9kb, ssRNA, Ja

AAV, ~4,5kb, ssDNA, selten

Adenovirus, <=35kb, ssDNA, Nein

35
Q

Was unterscheided das Gamma retrovirus von den anderen drei Virusvektoren grundlegend?

A

gamma-Retrovirus infiziert nur teilungsaktive Zellen

36
Q

Nenne drei Merkmale von Adeno-Assoziierten Viren

A

-Keine Hülle
-ssDNA Virus
-nicht Humanpatogen

37
Q

Wie vermehrt sich das AAV

A

Episomal mit Hilve von Adenoviren als Hilfsvirus. Integration in Wirtsgenom selten

38
Q

Welche Merkmale hat das Adenovirus?

A

Lineare dsDNA
keine Hülle
Erkältungssymptome bei Menschen

39
Q

Klonierungskapazität von Plasmiden?

A

0.1-10 kb

40
Q

Klonierungskapazität von lambda-Phagen?

A

replacement vektor:15-20 kb
Insertionsvektor: 0.1-5kb

41
Q

Klonierungskapazität von P1-Phagen?

A

80-100kb

42
Q

Klonierungskapazität von menschlichem Artificial Chromosome?

A

> 2000kb

43
Q

Nenne die Schritte für die Expression von klonierten Proteinen in Bakterien mit Plasmidvektor (6)

A
  1. Vektor restriktion
  2. Isolation und Restriktion von Target-DNA
  3. Ligation (Reading Frame darf nicht kompromitiert sein)
  4. Transformation in kompeten Bakterien und Selektion von rekombinanten Klonen
  5. Induktion der Expression (z.B. mit IPTG) und Bakteriensammlung
  6. Bakterienlyse, Verifikation von Expression mittels SDS-Page, (coomasie staining) Aufreinigung von Proteinen entsprechend dem Tag
44
Q

Wie wird die Target DNA oft gewonnen?

A

PCR

45
Q

Welche Art von Restriktionsenzymen wird typischerweise beim Klonieren verwendet?

A

Typ II-Restriktionsenzyme

46
Q

Welche subtypen von Typ II Restriktionsenzymen gibt es?

A

4-, 6- und 8-base cutter

47
Q

Was ist der Unterschied zwischen Sticky- und Blunt ends?

A

Blunt ends: kein Überhang an Schnittstelle
Sticky ends: 3’/5’ Überhang an schnittstelle

48
Q

Was ist der Vorteil bei der Verwendung des selben Restriktionsenzyms bei der Restriktion von Vektor und GOI?

A

kompatible sticky/blunt ends, was die Legierung deutlich erleichtert

49
Q

Wie wird RNA kloniert?

A
  1. Vektor restriktion
  2. Isolation und Aufreinigung von target-RNA
  3. Reverse Transkription in komplementäre cDNA durch reverse Transkriptase
  4. Ligation (Reading Frame darf nicht kompromitiert sein)
  5. Transformation in kompeten Bakterien und Selektion von rekombinanten Klonen
  6. Induktion der Expression (z.B. mit IPTG) und Bakteriensammlung
  7. Bakterienlyse, Verifikation von Expression mittels SDS-Page, (coomasie staining) Aufreinigung von Proteinen entsprechend dem Tag
50
Q

welche Enzymaktivitäten hat reverse Transkriptase?

A

RNA- abhängige DNA Polymerase
DNA-abhängige DNA Polymerase
RNAse H

51
Q

Nenne die vier häufigsten Protein-Tags

A
  • His tag (6x Histidin)
  • GST tag (enzyme)
  • GFP tag (fluorescent protein)
  • FLAG tag or HA tag (epitope tags)
52
Q

Wie werden Proteintags in Proteine eingebracht?

A

Insertion in DNA des zielproteins (c-terminal, n-terminal oder internal) mittels Klonierungsverfahren. Reading frame muss gewahrt bleiben

53
Q

Was wird beim GST-Pulldown untersucht?

A

Protein-Protein interaktionen

54
Q

Nenne das Schema des GST Pulldowns

A
  1. Aufbringen von Bakterienlyse mit GST-Tagged Protein auf Glutathion Sepharose beads -> GST- Tag bindet an Beads
    2.Waschen der Beads -> Entfernung aller nicht gebundenen Proteine
  2. Zugabe von möglichem (zu untersuchendem) Komplementärprotein -> Bindung von Komplementärprotein an gebundenes Protein
  3. Waschen -> Entfernen nicht gebundener Komplementärproteine
  4. Zugabe von Glutathionen -> Ablösung des Proteinkomplexes von den Beads durch Übersättigung
  5. Entfernen der Beads

Ergebnis: tagged protein und gebundenes Protein verbleiben in der Lösung, sofern eine Proteininteraktion stattgefunden hat. Andernfalls verbleibt nur das tagged protein

55
Q

Nenne die Sequenz des HA-Tags, sowie dessen Erkennungsmechanismus und Anwendungsbereich

A

YPYDVPDYA
Erkennung durch kommerziell erhältliche Antikörper
Für Proteinlokalisation und Colokation mit Proteinen/Organellen

56
Q

Nenne drei Cloning Shortcut techniques

A
  1. Gateway technologie
  2. TA-Cloning (z.B. TOPO TA-cloning)
  3. Gibson Assembly
57
Q

Was ist der Vorteil beim TA-cloning und wie kommt dieser zu stande?

A

Keine Restriktionsenzyme notwendig

Erreicht durch Erstellung von PCR Produkt mit A-Overhang, z.B. durch Taq-Polymerase, in Kombination mit einem Vektor mit T-Overhang an der cloning site

58
Q

Wie Funktioniert TOPO-Cloning?

A

Benötigt kein Restriktionsenzym,
TOPO-Vektor besitzt gebundene Topoisomerase I (agiert als Restriktionsenzym und ligase)

59
Q

Was ist der Grundsatz von Gateway-cloning?

A

DNA-Replikation wärend Phageninsertion

Attachment site paires vorhanden in Vektor/GOI:
attB/P (bacteria/Phage)
attL/R(Left and Right)

60
Q

Wie Funktioniert Gateway-Cloning

A

Erst BP-Cloning, dann LR-Cloning

flankiert hier: eine Sequenz pro seite

BP-Cloning: Target flankiert von attB, ccdB Sequenz im Donorvektor flankiert von attP.
BP-Klonase führt Rekombination durch,
Resultat: GOI insertiert in Entry-Vektor, Flankiert von attL, ccdB Sequenz als Nebenprodukt, flankiert von attR

LR-Cloning: Entry-Vektor+Zielvektor (enthält ccdB gen flankiert von attR)
LR-Clonase führt Rekombination durch
Resultat: Expressionsklon (GOI Flankiert von attB in vorherigem Zielvektor)+toxischem Nebenprodukt (ccdB gen flankiert von attP in vorherigem entry-Vektor)

61
Q

Was sind die Vorteile von Gateway-cloning?

A

Schnell
sehr effizient
Leicht auf andere Expressionssysteme übertragbar

62
Q

Was ist die Gibson-Assembly?

A

Exonukleasebasierte Methode zur Assemblierung von DNA-Fragmenten zu Vektor

63
Q

Beschreibe das Schema der Gibson-assembly

A

Benötigt in Tube: dsDNA mit überlappenden Enden (z.B. PCR Produkt)+Exonuklease+Polymerase+Ligase
1. Exonuklease verdaut 5’enden, Überhang entsteht
2. komplementäre Überhänge (gegeben durch überlappung der Fragmente) lagern sich aneinander an
3. Polymerase ergänzt Stränge durch Verlängerung der 3’-enden
4. ligase entfernt die Einschnitte.

64
Q

Nenne sieben Selektionsstrategien

A
  1. Auxotrophieselektion (Hefe)
  2. Blau-Weiß-selektion
  3. ccdB-Screening
  4. Screening nach Restriktionsprofil
  5. PCR-basiertes Koloniescreening
  6. Limited Dilution Assay
65
Q

Was ist Auxotrophische Selektion bei Hefe

A

Verwendung von auxotrophen Hefestämmen. Anwesenheit von Marker bei erfolgreicher Insertion gleicht auxotrophie aus.
-> Hefe überlebt in auxotrophiespezifischer Mangelumgebung nur mit Marker

66
Q

Was ist ccdB-screening?

A

ccdB-sequenz codiert für ccdB-Toxin, insert in ccdB gen (bzw. anstatt, in Gateway cloning) -> nur Bakterien mit erfolgreichem Insert überleben

Molekularbilolgie 2024/25 (13 decks)

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