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Molekularbilolgie 2024/25 > CRISPR/Cas > Flashcards

CRISPR/Cas Flashcards

Vorlesung 7

1
Q

Nenne drei Funktionen von CRISPR/cas

A

-Verteidigungsmechanismus gegen Fremd-DNA
-Adaptive und Vererbbare Immunität
-Vermittlung von Resistenz gegen das Eindringen von Fremd-DNA

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2
Q

In welchen Organismen kommt CRISPR/cas vor?

A

Prokaryoten (~45% der Bakterien und ~90% der Archaen)

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3
Q

aus welchen Komponenten besteht CRISPR/cas?

A

-CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats):
abschnitte sich wiederholender, palyndromischer DNA im Bakteriengenom
-cas-gene: Kodieren für eine große und heterogene Gruppe an Proteinen,
die an der Abwehr beteiligt sind (CRISPR-associated)

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4
Q

Nenne die Bestandteile des CRISPR-arrays.

A

Leader

CRISPR-Array

Repeat

Spacer

Protospacer

Pre-Spacer

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5
Q

Wie lang ist der CRISPR-Leader und welche Funktion hat er?

A

Länge: ~100-500 bp
Enthält Promotor zur Transkription des CRISPR-Lokus

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6
Q

wie viele CRISPR-Arrays kommen im Schnitt pro Organismus vor?

A

Anzahl pro Genom: durchschnittlich 3 in Bakterien, 5 in Archaeen

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7
Q

Nenne vier Eigenschaften der CRISPR-repeats

A
  • Länge ~20 bis ~50 Bp
  • Pro Lokus: 2 bis einige Hunderte idente Repeats
  • Oft palindromische Sequenz
  • Sequenz und Länge abhängig vom CRISPR-Typ
    und vom Organismus
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8
Q

Nenne vier Eigenschaften der Spacer

A

-Länge: meist ~20 bis ~70 Bp
- Hypervariable Sequenzen im CRISPR-Array
- Entstammen der DNA von Viren und Plasmiden
- Pro Lokus: 1 bis einige Hunderte

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9
Q

Was ist ein Protospacer?

A
  • Sequenzabschnitt in Fremd-DNA (z.B. Phage)
  • Verkürzte, prozessierte DNA wird als Spacer im
    CRISPR-Array eingebaut
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10
Q

Was ist ein Pre-Spacer?

A
  • Sequenzabschnitt in Fremd-DNA (siehe Protospacer) mit PAM
    PAM (protospacer adjacent motif):
  • 2-5 Nukleotide lange Sequenz, die den Protospacer flankiert
  • Selektion des Protospacers durch Erkennung der PAM
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11
Q

Wie viele Cas-Gene enthält ein Cas-Operon?

A

3 - >10

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12
Q

Wovür codieren Cas-Gene und wo sind sie zu finden?

A

Cas-Proteine (enthalten Nuklease-, Helikase-, Polymerase- und DNA/RNA/Nukleotidbindungsdomänen), meist nahe eines CRISPR-Arrays.

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13
Q

Was für Komplexe bilden Cas-Proteine?

A

Nukleoproteinkomplexe mit RNA/DNA

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14
Q

an welchen Prozessen sind Cas-Proteine beteiligt?

A

Spacer-adaption

CRISPR-RNA-Biogenese

Interferenz

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15
Q

Gibt es nur ein CRISPR-Cas-System?

A

Nein. 2 Klassen, 6 Typen und über 30 subtypen

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16
Q

Nenne den Unterschied zwischen dem Aufbau von CRISPR/Cas Klasse 1 und 2

A

Klasse 1: Multiprotein Effektor komplex (z.B. Cas 6,7,5, 11, 8,13)

Klasse 2: Einzelnes Effektor-protein (z.B. Cas 9)

17
Q

Wo kommen die einzelnen Klassen von CRISPR-Cas vor?

A

Klasse 1-Systeme finden sich in 90% der CRISPR-Loci in Bakterien & Archaeen

Klasse 2-Systeme finden sich in 10% der CRISPR-Loci ausschließlich in Bakterien

18
Q

Nenne die drei Phasen des CRISPR/Cas Abwehrmechanismus

A

Phase 1: Adaption

Phase 2: Expression & Maturierung von crRNAs

Phase 3: Interferenz

19
Q

Nenne die Schritte der CRISPR/Cas Adaption

A
  1. Erkennung von Fremd-DNA nach Erstinfektion
  2. Fragmentierung von Fremd-DNA
  3. Erkennung von Fragment als Pre-Spacer durch PAM-Präsenz
  4. Prozessierung von Pre-Spacer zu Proto-Spacer (PAM-Entfernung)
  5. Spaltung des am Leader-Ende liegenden
    Repeats im CRISPR-Lokus
  6. Einfügen des neuen Spacers
  7. Auffüllen der jeweilig fehlenden Repeat-Sequenz
20
Q

Welche Proteine sind für die Spacer-Integration zwingend erforderlich?

A

Cas 1 und 2

21
Q

Warum muss das PAM-Motiv vor der Integration entfernt werden?

A

um eine fehlerhafte Erkennung des CRISPR-Lokus als Fremd-DNA (Und dementsprechende Degradation) zu verhindern

22
Q

Nenne die drei Schritte der CRISPR/Cas Expression

A
  1. Expression von Cas-Genen
  2. Transkription des CRISPR-Arrays zur Vorläufer-RNA
    (pre-crRNA)
  3. Prozessierung in kleine CRISPR-RNAs (crRNA)
23
Q

Was ist die CRISPR/Cas-Interferenz?

A

Spezifische Erkennung und Abbau der Fremd-DNA durch
einen Komplex bestehend aus Cas-Proteinen & crRNA
(RNA-vermittelte DNA-Interferenz)

24
Q

Beschreibe die Prozessierung der pre-crRNA in CRISPR-Cas Typ 1

A

Endoribonuklease Cas-6 bindet an Spacer-hairpin

Spaltung nach hairpin formt 3’-handle, rest des Spacers formt 5’-handle der nächsten crRNA.

3‘ handle bleibt mit Cas6 assoziiert

5‘ handle für Positionierung im Überwachungskomplex wichtig

25
Q

Was ist tracrRNA?

A

Transactivating CRISPR-RNA; 25-nt lange Sequenz, komplementär zu CRISPR-repeats

26
Q

Beschreibe die Prozessierung der pre-crRNA in CRISPR-Cas Typ 2

A

Basenpaarung zwischen tracrRNA und crRNA führt zur Bildung einer Doppelstrang-Region, die als Substrat für RNase III (Cas 9) dient

Trimming durch unbekannte Ribonuklease; entfernt die 5‘-Repeat-Sequenz

27
Q

Woraus besteht der CRISPR-Überwachungskomplex in Typ 1 und 2?

A

Typ 1: crRNA und Proteinkomplex bestehend aus 11 Untereinheiten gebildet durch 5 verschiedene Cas-Proteine (CAsCADe (CRISPR-Associated Complex for Antiviral Defense))

Typ 2 (beispiel Cas 9): Ribonukleoproteinkomplex aus Cas 9 und tracr-/crRNA-hybrid; tracr-/crRNA Repeat benötigt für korrekte Positionierung und Verankerung in Cas9

28
Q

Beschreibe in 6 schritten die CRISPR/Cas Typ 1 vermittelte DNA-Interferenz

A
  1. Cascade sequenz sucht Fremd-DNA nach Protospacer mit PAM ab
    (PAM sequenz liegt auf dem zur crRNA komplementären Strang (target strand)
  2. Erkennung und Bindung von PAM durch Cas8

3.Basenpaarung zwischen crRNA-seed-sequenz (~7nt) und target strand

  1. komplette Basenpaarung von crRNA und spacer-sequenz in target strand. bildung von R-loop
  2. Rekrutierung von Cas3 (Nuklease-Helikase)

6.Cas3-vermittelte DNA-Degradation (schnitt am Off-target strand, danach Helikase Aktivität von Cas3)

29
Q

Beschreibe in 6 schritten die CRISPR/Cas Typ 2 vermittelte DNA-Interferenz

A
  1. Cas9-crRNA-tracrRNA-Komplex sucht Fremd-DNA nach Protospacer mit PAMs ab. Die PAM-Sequenz liegt auf dem Non-Target-Strang, der zur crRNA nicht komplementär ist
  2. Erkennung von PAM durch Cas9
  3. initiale Basenpaarung von crRNA-seed-sequenz (~12nt) mit target strand
  4. komplette Basenpaarung von crRNA und target strand, R-Loop bildung
  5. Spaltung durch Cas9-nukleaseaktivität 3bp upstream von PAM, Doppelstrangschnitt, generiert Blunt ends
  6. Degradation durch weitere DNAsen
30
Q

Nenne vier Anwendungsbeispiele für CRISPR/Cas

A
  1. Einbringen von Phagenresistenzen in industriell bedeutsame Bakterien (z.B. Milchsäurebakterien in Käseproduktion)
  2. identifizierung pathogener Bakterienstämme
  3. Knockdown von endogenen Genen durch Transformation Plasmid-kodierter spezifischer CRISPR-Sequenzen

4.Genome Editing in Eukaryonten

31
Q

Nenne die RNA, die den tracr-crRNA komplex beim Genome Editing in Eukaryonten ersetzt

A

sgRNA (single guide RNA), Fusion aus crRNA und tracrRNA

32
Q

wie werden die Doppelstrangbrüche in der DNA repariert, die Cas9 erzeugt?

A

nicht-homologe Endverknüpfung oder homologe Reparatur

33
Q
A

Molekularbilolgie 2024/25 (13 decks)

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