regulation expression gene (post transcription) Flashcards
Régulation post transcriptionnelle
Qualitative
Quantitative
Qualitative
Epissage alternatif
Edition
Quantitative
Dégradation du messager
Rôle des MIR (micro ARN)
Régulation de la traduction
épissage intronique
Grande quantité d’ARN transcrite puis éliminée
Coût énergétique++
Risque d’erreurs et de mutations
Epissage alternatif
•Le séquençage du génome humain a montré l’existence de …. gènes codants
pour des protéines
•Au moins …. protéines
•1 gène : au moins … transcrits et en moyenne ….. transcrits différents
•….% des gènes ont un épissage alternatif
- Le séquençage du génome humain a montré l’existence de 20 000-25 000 gènes codants pour des protéines
- Au moins 100 000 protéines
- 1 gène : au moins 2 transcrits et en moyenne 6-8 transcrits différents
- 90% des gènes ont un épissage alternatif
Epissage alternatif
physiologique
Combinaisons différentes des exons d’un gène
L’épissage alternatif génère des isoformes protéiques ayant des propriétés biologiques spécifiques
Combinaisons différentes des exons d’un gène
csq
Protéines fonctionnellement distinctes
Variabilité tissulaire
Variabilité dans le temps (au cours de développement)
Variabilité de réponse à un signal cellulaire
L’épissage alternatif génère des isoformes protéiques ayant des propriétés biologiques spécifiques
modif :
Interactions protéines/protéines
Localisation sub-cellulaire
Activité catalytique
Epissage alternatif pathologique qui résulte
De mutations des séquences consensus d’épissage « CIS »
De mutations de séquence (intron/exon) hors des séq consensus
D’anomalies des protéines du spliceosome ou de protéines régulatrices « TRANS »
L’épissage alternatif pathologique génère
des isoformes protéiques ayant des propriétés biologiques anormales
L’épissage alternatif pathologique
csq
- > Modification des interactions protéines/protéines
- > Modification de la localisation sub-cellulaire
- > Modification de l’activité catalytique
- > Absence de protéine
Différents types d’épissage alternatif
Exclusion inclusion d’exon
Site alternatif en 3’
->Délétion exonique
Site alternatif en 5’
-> Délétion exonique
Eclusion mutuelle d’exon
Rétention d’intron
Epissage alternatif impliquant le promoteur et le site de poly-Adénylation (promoteur ou site poly a multiple)
Les déterminants de l ’épissage : séquences en « CIS »
ont un impact sur l’epissage
raison principal que l’episssage puisse etre alternatif
qu’est ce qui determine leur affinité pour des facteurs d’épissage
ont un impact sur l’epissage :
•Les séquences autour des séquences consensus
•La taille de la séquence de pyrimidine en 3
raison principal que l’episssage puisse etre alternatif : force des sites bornant les
exons en 5’ et 3’
qu’est ce qui determine leur affinité pour des facteurs d’épissage : La similitude à une séquence « idéale »
Sites faibles
Nécessitent des facteurs additionnels (protéines)
Qui se lient à des séquences régulatrices
Activatrices ou inhibitrices de l’épissage
Site fort
Constitutifs
csq site fort et faible
- La présence de régulateurs va déterminer de taux d’inclusion ou non d’un exon
- La position des sites faibles/forts va entrainer un épissage alternatif
- Des facteurs régulant la transcription peuvent aussi moduler l’épissage
Les déterminants de l ’épissage en CIS : couplage avec la transcription
elongation rapide
elongation ralentie
Elongation rapide : préférentiellement recrutement de la machinerie d’épissage
en 3’ fort
Elongation ralentie : recrutement du spliceosome au niveau du site 3’ faible
Les déterminants de l ’épissage en TRANS
SR : protéines d’épissage +: contiennent des séquences riches en Serine (S) /Arginine (R)
recrutement snRNP U1+U2
hnRNP : Heterogeneous nuclear ribonucleoproteins (complexes ARN/Protéine)
inhibitrices : masquage des sites
Les déterminants de l ’épissage en TRANS
ESE ISE ESS ISS
ESE: exonic splicing enhancer : séquence exonique fixant des facteurs activant l’epissage
ISE: intronic splicing enhancer : séquence intronique fixant des facteurs activant l’epissage
ESS : exonic splicing silencer : séquence exonique fixant des facteurs inhibant l’epissage
ISS : intronic splicing silencer : séquence intronique fixant des facteurs inhibant l’epissage
Epissage alternatif et pathologie
differente anomalie
Mutations des séquences CIS :
Séquences «CIS» consensus
Séquences «CIS» ESS ESE ISS ISE
Anomalies fonctionnelles Anomalies quantitatives : Eléments «TRANS» Protéines qui lient ESS ESE ISS ISE Les protéines du spliceosome
Epissage alternatif et pathologie
csq
Retentissement sur la qualité de l’épissage > évènements d’épissage aberrants
•Maladies d’origine génétique
•Pathologies acquises (cancer)
Epissage alternatif et pathologie : les différentes altérations
en cis
1 : mutations du site de branchement
2 : mutations affectant la région riche en pyrimidines
3 : mutations du site consensus 3’
4 : mutations du site consensus 5’
R : mutations des sites régulateurs introniques ou exoniques
Cas des mutations germinales
Données de la base «HumanGene Mutation Database» : … % des mutations constitutionnelles associées à une pathologie sont des mutations du ….
Une mutation de … peut conduire à la ….
Exemple du gène … dont les mutations sont impliquées dans la mucoviscidose
Données de la base «HumanGene Mutation Database» : 30% des mutations constitutionnelles associées à une pathologie sont des mutations du site d’épissage
Une mutation de site d’épissage peut conduire à la synthèse d’une protéine partiellement fonctionnelle
Exemple du gène CFTR dont les mutations sont impliquées dans la mucoviscidose
Cas des mutations germinales
que pasa cas 1
- Décalage du cadre de lecture
- STOP prématuré
- Pas de protéine > Phénotype sévère
Cas des mutations germinales
2e cas
Pas de décalage du cadre de lecture Pas STOP prématuré Protéine présente Fonction? Faire des tests fonctionnels
Epissage alternatif et pathologie : exemple 3
Mutation d’un ESE
- Pas de décalage du cadre de lecture
- Protéine fonctionnelle?
- Synthèse possible du transcrit complet en quantité plus faible
- Phénotype potentiellement moins sévère
Interprétation de la mutation est plus difficile et il faut une analyse fonctionnelle
Pour statuer sur la pathogénicité de l’altération
Mutations (2) affectant la région riche en pyrimidines, CTFR
site avec repetition TG nb TG variable : microsatelite quand nb TG augmente ARNm contenant cet exon diminue entraine survenue maladie •Formation de structures 2nd qui entravent l’épissage normal •Conséquence quantitative
Cas des mutations Somatiques (Cancer)
•La fréquence des mutations d’épissage est variable en fonction du type de gène impliqué
•Anomalies très fréquentes de l’épissage alternatif « normal »
Exemple TP53 : touchée par des mutations classiquement « perte de fonction »
> Dans la tumeur la protéine ne fonctionne pas ou ne s’exprime pas
Cas des mutations Somatiques (Cancer)
Exemple MET
récepteur au facteur de croissance FGF Protéine MET est très exprimée ARNm est exprimé, délétion de l’exon 14
Altération activatrice
Code pour une région régulatrice : freine
L’activité du récepteur
Interprétation biologique des anomalies de la transcription
Interprétation du caractère causal
2 stratégies majoritaires
Complexe parce qu’un même « type » d’anomalie peut conduire à des phénotypes
différents = expression de l’anomalie ou de la pathologie différentes
Conséquences : activation/inhibition/phénotype sévère/modéré
L’approche ADN et l’approche ARN
Approche ADN
L’approche la plus couramment utilisée en diagnostic
ADN est une molécule robuste facile à extraire
L’analyse devra comprendre les jonctions INTRON/EXON sur environ 120 pdb dans l’intron
Toute anomalie au delà ne sera pas identifiée
•sauf très haut débit étude du génome ou séquence génomique complète
Approche ADN
Interprétation
Variant est connu > simple
Variant est non connu
•modélisation bioinformatique qui « prédit » l’impact fonctionnel
•clinique et l’arbre généalogique
•passer à l’ARN
•tests fonctionnels (difficiles cas particuliers rares)
L’approche ARN
Relais à l’approche ADN (petites séries, cadre de la recherche, cas particuliers)
ARN est une molécule fragile > risque de dégradation +++
Problème de la spécificité tissulaire le sang n’est pas forcément un bon reflet du tissu d’intérêt (sang? tissu?)
Le problème du NMD (Non-sens Mediated RNA Decay)
L’approche protéine… (recherche)
Tumeurs : on peut regarder l’expression de la protéine dans le tissu tumoral assez simplement
Correction des anomalies de la transcription
Aspect thérapeutique
Approche expérimentale
Aspect thérapeutique
Le rôle majeur joué par les anomalies de l’épissage en pathologie
Mise en place de stratégies correctives
Approche expérimentale
Utilisation d’oligonucléotides antisens (ASO) pour bloquer ou faciliter l’épissage
Dégradation des ARNs
La dégradation des ARN messagers est un processus cellulaire
•Régule la production de protéine en réponse aux conditions de l’environnement
cellulaire
•Elimine des ARN défectueux.
Dégradation des ARNs
processus
Dégradation 5’3’ (XRN1)
Nécessite des enzymes de de-capping (DCP1/2)
Déadenylation
Dégradation 3’5’
Dégradation des ARNs qui quoi pk degradation quoi
- Tous les ARNs (r, t, m….)
- Répression traductionnelle
- Contrôle qualité des ARN
- Dégradation des Introns
- Turn over des nucléotides et recyclage
Nonsense-mediated mRNA decay
NMD
La dégradation des ARN messagers porteurs d’un codon STOP prématuré (PTC :
premature terminal codon)
Mécanisme de surveillance, de contrôle qualité des ARNm
Aspect crucial : distinguer un codon stop « normal » / « prématuré »
dépendante de l’épissage et liée à la
signalisation des jonctions intron/exon par des protéines : EJC : « exon junction
complex »
Nonsense-mediated mRNA decay
(NMD)
processus
si codon stop premature précède > 50 Nu avant dernier EJC
Interaction entre les facteurs de fin de traduction « eRF » et les EJC via le recrutement de protéines du complexe
NMD
Phosphorylation de UPF1 : protéine majeure du système NMD
Formation d’un complexe : SURF
Libération (eRF3+eRF1+UAA)
Activation de la dégradation du messager
Endonucléases
Nonsense-mediated mRNA decay (NMD)
Le plus souvent en pathologie :
L’existence d’un codon stop précoce induit l’activation d’un système de contrôle qui permet la dégradation du messager avant
sa traduction en protéine : NMD
On peut ne pas mettre en évidence le messager si très instable
On ne met pas en évidence la protéine tronquée
Nonsense-mediated mRNA decay (NMD)
Rôle physiologique
Régulation de l’expression des isoformes protéiques
Il existe de très nombreux exemple
1 exemple : maturation des globules blancs
Suppression des réarrangements d’immunoglobuline
non productifs
Régulation de la transcription/traduction par les MIR
(micro-ARN)
•Les MIRs :
•Ces molécules ont un rôle.. dans
•À ce jour, plus de … micro-ARN matures ont été découverts chez l’homme
•… % du génome est … par les MIRs
•Un gène peut être régulé par … micro-ARN
•… micro-ARN peut réguler …. gene du fait de ….
•Les MIRs : petits ARN non codants
•Ces molécules ont un rôle clé dans la régulation post-transcriptionnelle de
l’expression des gènes et leur expression est elle-même finement régulée
•À ce jour, plus de 2 500 micro-ARN matures ont été découverts chez l’homme
•50 % du génome est régulé par les MIRs
•Un gène peut être régulé par plusieurs micro-ARN
•un seul micro-ARN peut réguler plusieurs gènes du fait de la complémentarité
souvent partielle
Action des micro-ARN
Les MIRs ont une séquence complémentaire localisée dans la région 3’ UTR de leur gène cible
miARN gene donne pri -miARN puis grace a prot DROSHA -> pre miARN puis exportin l’envoi dans le cytoplasme
sous forme duplex miARN -> se detache puis s’associe au complexe RISC -> degrade messager
Action des micro-ARN
Les MIRs ont une séquence complémentaire localisée dans la région 3’ UTR de leur gène cible
Régulateurs négatifs de l’expression des gènes
Rôle physiopathologique des MIRs (micro-ARN)
L’expression des MIRs est tissus-spécifique
•Ils ont un rôle majeur dans les processus de développement
et la différenciation cellulaire
Des altérations de l’expression des MIR est associé à de
très nombreuses pathologies
•Les cancers
•Les maladies cardiovasculaires
•Les syndromes inflammatoires
Ex MicroARN et CANCER
Sous-expression du MIR let-7 est liée à la prolifération via le control de l’expression transcriptionnelle de KRAS (prot oncogene)
Etude des micro-ARN
PUCE d’expression
•Profils d’expression
RTqPCR individuelle
•Etudier 1 ou quelques MIRs particuliers
Séquençage
•Quantifier les MIR (séquençage nouvelle génération)
•Identifier des anomalies de séquence et isoformes
Manipulation pour éteindre des gènes
•Les shARN (transformés en miRNA) et siRNA sont des ARN double brin
exogènes qui entrent dans les cellules via un vecteur (transfection
directe, virus, plasmide..)
•On peut les utiliser pour éteindre l’expression d’un gène un vitro
•Ils sont parfaitement complémentaires
Inhibition traduction
L’inhibition de la traduction est un élément majeur de la réponse aux stress cellulaires
L’initiation de la traduction est une cible privilégiée de régulation
mTOR et les EIF2K sont deux intégrateurs essentiels des stress carentiels
Des systèmes de traduction sélective de certains ARNm existent
Ces intégrateurs régulent des fonctions biologiques adaptatrices dépassant la traduction
Modulation spécifique et pré conditionnement
