Regulation de l'expression des genes

Question 1

etat condensation chromatine

Answer 1

• > Hétérochromatine : l’ADN est très compacté = conformation « fermée » => très faible niveau de transcription (répression)
• > Euchromatine : l’ADN est très peu compacté = conformation « ouverte » => permet l’activation de la transcription du gène qui devient accessible à la fixation des facteurs de transcription (éventuellement les facteurs activateurs et le complexe d’initiation de la transcription), et cette fixation protège du clivage de l’ADN par la DNase

Question 2

Modifications post- traductionnelles des histones

Answer 2

post-traductionnelles réversibles, avec des spécificités d’histones et de sites d’actions sur ces histones (« Code Histones ») :
• Acétylation des Lysines
• Méthylation des Arginines et Lysines
• Phosphorylation des Serines
• Ubiquitination, sumoylation
Les modifications post-traductionnelles peuvent interagir et se réguler entre elles

Question 3

Acétylation des Lysines

Answer 3

par les Histone Acétylases (HAT) fait perdre à la lysine sa charge positive, réduisant la force de l’interaction entre histone et ADN (chargé -). Cette décompaction favorise l’accès à d’autre protéines (ex : complexes de remodelage de la chromatine et facteurs de transcription) et donc l’expression des gènes. (Modification réversible : la désacétylation par les Histone Désacétylases (HDAC) induit l’effet inverse = une répression de l’expression des gènes)

Question 4

Méthylation des Arginines et Lysines

Answer 4

sites de recrutement de protéines activatrices ou inhibitrices de la transcription.

Question 5

Méthylation de l’ADN

Answer 5

Les résidus de cytosine des dinucléotides CpG peuvent être méthylés en 5-méthylcytosine
la méthylation de la cytosine d’un gène peut inactiver ce dernier dans le cadre d’un mécanisme plus général relevant de l’épigénétique
70 % à 80 % des résidus de cytosine des dinucléotides CpG sont méthylés
les dinucléotides CpG définissent des îlots CpG dans lesquels leur concentration est bien plus élevée et qui jouent un rôle dans la régulation de l’expression génétique.

Question 6

méthylation et empreinte

Answer 6

Méthylation et empreinte :

• > Le niveau d’expression d’un gène dépend de son origine parentale
• > On connaît aujourd’hui près de 300 gènes soumis à l’empreinte (souvent dans une même région)
• > Les problèmes de méthylation sont associés à de nombreuses maladies génétiques et processus cancéreux.

Question 7

Facteurs de transcription
generalité 
transcription conditionné par quoi 
facteur trans (souvent quoi) = 
region cis (souvent quoi) = 
situé ou

Answer 7

transcription est conditionnée par la fixation d’un certain nombre de protéines appelées facteurs trans qui régulent la transcription en reconnaissant des séquences spécifiques de l’ADN (éléments cis), en amont des gènes dans le promoteur, et qui peuvent être très éloignées des gènes dont ils régulent l’expression. Ces séquences cis sont consensus, souvent palindromiques car les facteurs de transcription sont souvent dimériques.

Question 8

Facteurs trans contrôlant l’initiation de la transcription

Answer 8

facteurs de transcription ubiquitaires reconnaissant des séquences d’ADN spécifiques « core promoter » localisées en amont du site de démarrage de la transcription, appelés « basal factors » ou facteurs de base : TATA box binding protein (TBP) et TBP associated factors (TAF).
Les facteurs de base permettent au complexe d’initiation de la transcription, dont l’ARN polymerase II, de se fixer au bon endroit, dans le promoteur. Par leur faible fixation, ils permettent une régulation du taux basal d’expression des gènes.

Question 9

Facteurs de transcription régulateurs activateurs et répresseurs

Answer 9

se fixent sur le promoteur proximal (-50 à -500) sur les CAAT box ou les GC box.
Les facteurs de transcription activateurs ou répresseurs sont à l’origine de la spécificité tissulaire ou cellulaire de l’expression d’un gène, et reconnaissent des éléments cis « enhancers » (->activation de la transcription) ou « silencers » (blocage de la transcription) en amont ou en aval du site d’initiation de la transcription, et agissent seuls ou en association avec des co-activateurs ou co-répresseurs qui ne lient pas directement l’ADN.

Question 10

Facteurs de transcription activateurs
sous forme quoi suite a quoi
Plusieurs domaines
sequence cible reconnue par quoi et peuvent etre comment

Answer 10

plupart sont actifs sous forme de dimères, suite à des modifications post-traductionnelles du domaine de dimérisation comme la phosphorylation.
possèdent un domaine de liaison à l’ADN et un domaine de transactivation permettant l’activation de la transcription, un domaine de dimérisation.
séquences cibles d’ADN reconnues par les monomères des FT peuvent être courtes et opposées, ou répétées, ou palindromiques

Question 11

Facteurs de transcription répresseurs

Answer 11

diminuent l’activité transcriptionnelle par deux modes d’action :

• > compétition vis à vis de l’activateur sur le site de liaison à l’ADN, ce qui empêche sa fixation
• > « quenching » : liaison au facteur activateur de la transcription soit au niveau de son domaine de liaison à l’ADN, soit au niveau du domaine de transactivation du facteur activateur

Question 12

Domaine d’interaction du facteur de transcription
fixation ADN par quel domaine
et comment est ce domaine

Answer 12

facteur de transcription aura par définition un domaine basique d’interaction avec l’ADN (acide désoxyribonucléique).
Le domaine de liaison à l’ADN du facteur de transcription comporte des motifs particuliers : la taille d’un grand sillon d’ADN correspond au diamètre d’une hélice alpha => élément constitutif privilégié de ces motifs.

Question 13

4 types FT

Answer 13

• > Hélice/coude = tour/hélice
• > Doigt de zinc
• > Dimère en Hélice/boucle/hélice (bHLH)
• > Dimère en Leucine zipper (hélice alpha) (bZiP)

Question 14

Northern Blot inconvenient

avantage

Answer 14

Peu sensible (nécessite beaucoup de matériel donc adapté uniquement aux gènes connaissant une forte expression).

SEULE méthode permettant de déterminer la taille d’un transcrit. Permet la détection des épissages alternatifs.

Question 15

RT PCR standard
avantage
inconv

Answer 15

Rapide
Ultrasensible
Quantitative = en temps réel : permet de déterminer le nombre de copies

Difficile de déterminer la taille d’un transcrit
Difficile de mettre en évidence un épissage alternatif (possible mais très long)

Question 16

RNA Sequencing
def
Protocole

Answer 16

: analyse globale des transcrits

1) Extraction de l’ADN
2) Conversion de l’ADN en ARN complémentaire
3) Fragmentation
4) Séquençage des différents fragments

Question 17

RNA Sequencing

resultat

Answer 17

• Info qualitative : si le séquençage a lieu, le gène s’exprime
• Info quantitative : le nombre de séquences obtenu est proportionnel au nombre de copies initial = niveau d’expression
  Cette méthode a l’avantage d’être très sensible, et de pouvoir se réaliser sur tous les gènes d’un tissu en même temps. Toutefois, elle reste longue.

Question 18

Mise en évidence des sites d’hypersensibilité à la DNASE I

principe

Answer 18

DNase I est une enzyme clivant de manière aléatoire l’ADN + facilement si si l’ADN est accessible, c’est à dire sous forme d’euchromatine.

test d’hypersensibilité à la DNase I se base sur la propriété de clivage de la DNase I. Si on incube, durant des périodes croissantes, une séquence d’ADN, prédigérée par des enzymes de restriction, avec une très faible quantité de DNase I, celle-ci va cliver l’ADN à des endroits spécifiques appelés site d’hypersensibilité à la DNase I.

Question 19

Mise en évidence des sites d’hypersensibilité à la DNASE I

Résultat

Answer 19

hypersensibilité à la DNase I permet de mettre en évidence :
- Si la DNase I arrive à cliver, l’ADN est ouvert sous forme d’euchromatine et donc on peut supposer que la région contient
des séquences fixant des régulateurs de la transcription.
- Si la DNase I n’arrive pas à cliver, l’ADN est fermé sous forme d’hétérochromatine et donc on peut supposer que la région ne contient pas de séquences fixant des régulateurs de la transcription.

Question 20

FOOTPRINTING

but

Answer 20

Étude des interactions ADN/protéines avec localisation du site de fixation de la protéine sur la séquence d’ADN étudiée (élément cis). Cette méthode est utilisée pour localiser le(s) site(s) de fixation d’un facteur de transcription sur un promoteur.

Question 21

FOOTPRINTING

principe

Answer 21

L’ADNg est marqué à l’aide d’un isotope radioactif.
On utilise de la DNAse I sur de l’ADN nu et de l’ADN avec des facteurs protéiques dont on soupçonne qu’ils peuvent se lier à l’ADN. La DNAse I va couper les brins d’ADN de manière non spécifique.
Les sites où une protéine est fixée vont être protégés et être inaccessibles pour la DNAse I

Question 22

FOOTPRINTING

protocole

Answer 22

On marque une séquence d’intérêt à une extrémité (5’ par exemple) et on réalise notre footprinting:
-> Dans un premier tube, on incube notre séquence marquée directement avec la DNAse I, elle coupe de manière non spécifique,
et statistiquement une fois par fragment.
-> Dans un second tube, notre séquence est préalablement incubée avec des extraits nucléaires contenant des protéines. Ensuite
seulement on incube ce mélange avec la DNAse I

Question 23

FOOTPRINTING

resultat

Answer 23

Une partie de la séquence n’a pas été clivée par rapport à l’électrophorèse de l’ADN nu. C’est ce morceau-là de la séquence qui est protégé de la DNAse I par une protéine, et le lieu de la fixation de cette protéine peut être déterminé par lecture sur l’électrophorèse

Question 24

GENES RAPPORTEURS

but

Answer 24

Étude du rôle et des régions fixant les facteurs de transcription du promoteur sur la régulation de l’expression d’un gène.
Utiliser pour visualiser ou mesurer l’expression d’un gène d’intérêt

Question 25

Gene rapporteur

principe

Answer 25

gène rapporteur est un gène qui n’est pas exprimé à l’état basal dans le type cellulaire étudié
le produit -la protéine- possède une caractéristique lui permettant d’être observé en laboratoire
Par exemple, la Luciférase pour laquelle on observe un rapport entre quantité de protéine traduite et luminosité émise.
L’étude de cette régulation et plus précisément des régions du promoteur sur lesquelles se fixent ses facteurs peut se faire grâce à l’utilisation de gènes rapporteurs

Question 26

RETARD SUR GEL

but

Answer 26

Mise en évidence de la liaison d’un facteur de transcription (FT) à une séquence ADN d’intérêt et de son rôle

Question 27

RETARD SUR GEL

Importance des contrôles de spécificité

Answer 27

-> Compétition entre l’oligonucléotide (ON) radiomarqué et l’ON froid (c’est-à-dire non radiomarqué) en excès : si la fixation du FT est spécifique, c’est l’ON froid en excès qui fixe majoritairement le FT et qui sera retardé (mais comme il n’est pas marqué, on ne voit pas ce retard). L’ON marqué étant minoritaire, il fixe peu (ou pas) le FT et continue donc lui de migrer : on ne révèle que peu (ou pas) de retard.

Question 28

RETARD SUR GEL

principe

Answer 28

Il s’agit d’une électrophorèse sur un gel de polyacrylamide NON DENATURANT
Pour savoir si une protéine X se fixe : incubation de l’ON et du mélange de protéines avec un anticorps anti-X. Si l’anticorps se fixe à la protéine X liée à l’ADN, on observe une 3ème bande plus haute que la 2ème qui correspond à un super- retardement (= supershift).

Question 29

RETARD SUR GEL

analyse resultat

Answer 29

• Si le FT n’est pas fixé : la migration des fragments d’ADN n’est pas freinée
• Si le FT est fixé : la migration est freinée (« shift »). La migration peut être encore plus ralentie lorsqu’un Ac dirigé contre la protéine fixée est ajouté et
  se fixe effectivement sur cette protéine (« supershift »).

Question 30

Immunoprécipitation de la chromatine (ChIP)

but

Answer 30

Étude de la liaison de la chromatine : identification des facteurs trans et de leurs gènes cibles.

Question 31

ChIP

Principe

Answer 31

Le séquençage des fragments d’ADN récupérés permet de déterminer les lieux de fixation du facteur de transcription => Permet d’établir la liste des gènes régulés par ce facteur de transcription

Question 32

ChIP

protocole

Answer 32

• On récupère les noyaux des cellules et on les traite au formaldéhyde (ou équivalents) = création de liaison entre les protéines nucléaires et l’ADN
• Fragmentation de l’ADN par sonication : libérer les complexes ADN/ protéines
• Immunoprécipitation avec des anticorps dirigés contre les protéines étudiées
• Récupération du culot : tous les fragments d’ADN liés au facteur de transcription
• Libération de l’ADN par chauffage
• Séquençage des fragments après amplification par PCR et éventuellement une
analyse à l’échelle du génome