Methode etude biologie moléculaire

Question 1

hybridation

Answer 1

• Propriété fondamentale des acides nucléiques (ADN ou ARN) simple brin à s’apparier ou s’hybrider avec un brin anti-sens pour former une molécule double brin
• Basée sur la complémentarité des bases G-C et A-T
• Obtention d’une information (présence, taille) sur une séquence cible au sein d’une population complexe de molécules d’ADN d’une cellule ou d’un extrait biologique
• Détection par une molécule complémentaire à la séquence cible appelée sonde

Question 2

denaturation

Answer 2

• Réversible

* Chaleur, pH, solvants organiques (urée, formamide)

Question 3

Notion de Tm

Answer 3

temperature ou 50 % des ADN sont dénaturé

Question 4

appariement

Answer 4

• duplex formé: ADN/ADN, ADN/ARN, ARN/ARN
• homoduplexes/hétéroduplexes
• complémentarités ≠ 100%
• support solide/liquide
• stringent : favorable a appariement homo
• pas stringent pas favorable a appariement homo

Question 5

Enzymes de restriction

Answer 5

• Fragmentation de l’ADN double brin
• Coupure spécifique et reproductible
• Site de restriction : soit a bout franc soit aux extremité cohesive

Question 6

SOUTHERN BLOT

Answer 6

Analyse qualitative et semi-quantitative de séquences d’ADN génomique :
principalement mise en évidence des grands remaniements
1- Isolement ADN
2- digestion enzymatique
3- separation fragments en fonction de leur taille
4- denaturation
5- transfert sur support solide gel-> membrane
6- Hybridation
7- Revelation

Question 7

NORTHERN BLOT

Answer 7

. Détection de molécules d’ARN spécifiques dans un mélange d’ARN à partir de tissus ou de cellules
. Purification des ARN totaux ou ARN polyA+
. Séparation par électrophorèse en fonction de la taille: conditions dénaturantes
. Destruction des structures secondaires

Question 8

Nothern blot

application

Answer 8

analyse qualitative (taille, nature des transcrits en fonction du stade du développement, spécificité tissulaire…; intermédiaires de maturation; anomalies d’épissage) et semi-quantitative des ARN

Question 9

PCR

Answer 9

. Obtention d’une séquence cible délimitée par un couple d’amorces
spécifiques de l’ADN d’intérêt (taille des amorces)
. Comprend 3 étapes répétées durant n cycles (en général 30-40):
étape1 : dénaturation ≈ 95°C
étape 2 : hybridation des amorces ≈ 50-60°C
étape 3 : extension (ou élongation) par l’ADN polymérase ≈ 72°C

Question 10

PCR propriete

Answer 10

réaction enzymatique en chaîne
spécifique
exponentielle => 2^n copies (n= nb cycles)

Question 11

Trois premiers cycles de la PCR :

Answer 11

Amplification exponentielle des fragments d’ADN dont les extrêmités correspondent aux
séquences des amorces (= produits PCR ou amplicons):
- Spécificité de la réaction liée aux amorces : une amorce ou primer s’hybride sur le brin sens de la matrice, l’autre amorce s’hybride sur le brin anti-sens (forward/reverse)
- L’orientation des amorces respecte le sens de l’élongation par l’ADN polymérase (5’ -> 3’)
- Amplification exponentielle des
fragments d’ADN

Question 12

Technique de Sanger

but

Answer 12

Déterminer l’ordre d’enchaînement des nucléotides d’une séquence d’ADN

Question 13

technique sanger

a partir de quoi

Answer 13

• Réalisation à partir d’un fragment d’ADN qui servira de brin matrice pour la synthèse du brin complémentaire : obtention du brin matrice par PCR (ou clonage)
• Taille des fragments séquencés: environ 500 pb et < 1000 pb

Question 14

technique sanger mecanisme

Answer 14

• Incorporation aléatoire de ddNTPs (radioactifs, fluorescents) ce qui provoque l’arrêt de l’élongation et qui permet le marquage de l’extrêmité 3’ du brin d’ADN
en cours de synthèse
• Le marquage de l’extrêmité du fragment synthétisé par le ddNTP permet d’identifier le nucléotide
• Lecture de la séquence: correspond en réalité à la lecture du dernier nucléotide incorporé
• Reconstitution de la séquence après électrophorèse des fragments synthétisés en fonction de leur taille

Question 15

interpretation Sanger

Answer 15

Mutation hétérozygote
2 pics sur la même position

Mutation homozygote
Un seul pic avec changement de
base

Question 16

RT PCR « reverse transcription PCR »

Answer 16

ARN 
->Transcriptase inverse
Amorces aléatoires ou spécifiques ADNc 
-> ADN polymérase / dNTPs / Amorces spécifiques
Produit PCR

Question 17

RT PCR application

Answer 17

• RT PCR en temps réel
• Séquençage
• Clonage dans des vecteurs d’expression

Question 18

Restriction Fragment Length Polymorphism

« PCR RFLP »

Answer 18

recherche d’une mutation qu’on connait
on applique enzyme de restriction qui coupe sur l’endroit de la mutation
ex : mutation qui abolit site de restriction
si ADN sauvage = ca coupe
ADN muté = ca coupe pas
sauvage : coupe pareil sur les 2 brins => 2 bandes en southern
heterozygote => 3 bandes
homozygote => 1 bande

Question 19

Analyse de fragments

permet

Answer 19

Mise en évidence de courtes ins/del

• détection d’un polymorphisme = nombre de répétitions d’un dinucléotide
• analyse des microsatellites dans les tumeurs

Question 20

Analyse de fragment

etape de réalisation

Answer 20

• amplification de la région à analyser (contenant le site polymorphe)
• utilisation d’amorces fluorescentes
• électrophorèse en gel capillaire
• détection des fragments marqués dans un séquenceur => pics
• possibilité d’analyser plusieurs sites polymorphes en même temps

Question 21

(RT) PCR en temps réel

Answer 21

A chaque cycle une fluorescence est émise
Le résultat d’une PCR en temps réel
est représenté graphiquement sous forme de courbes sigmoïdes.
Chaque courbe correspond à un échantillon
Elle représente la mesure de la
fluorescence (Sybr green©) de cet échantillon à chaque cycle de PCR.

Question 22

PCR temps reel cycle seuil

Answer 22

cycle seuil au moment où le signal s’écarte significativement de la valeur du bruit de fond; Ct inversement proportionnel à la quantité d’ADN (ou ADNc) de départ

Question 23

Application PCR temps réel

Answer 23

PCR quantitative
ADN= Détermination du nombre de copies d’un gène (délétion, duplication, amplifications
géniques)
ARN= quantification des transcrits (relative ou absolue => gène de référence ou gamme étalon)

Question 24

PCR en temps réel et mutations

Answer 24

discrimination allélique par sondes 
fluorescentes: mise en évidence de 
mutations connues grâce à deux
sondes fluorescentes spécifiques de la séquence non mutée 
(« sauvage ») ou mutée

détection des signaux de fluorescence spécifiques du
génotype au cours de la PCR : chez les individus hétérozygotes on observe les 2 types de fluorescence

Question 25

PCR en temps réel avantage

Answer 25

Méthode de génotypage 
- rapide
- ciblée 
- adaptée pour un nombre limité 
de mutations dans un gène donné
- très utilisée en diagnostic