Methode etude clonage Flashcards
def
insérer un ou des fragment(s) d’intérêt dans l’ADN génomique purifié d’un élément génétique autoréplicatif (virus ou plasmide)
but
obtenir un grand nombre de copies absolument pures d’une séquence donnée d’ADN
principe
Sélection d’un clone bactérien recombinant (vecteur + ADN) parmi
un ensemble de clones bactériens (banque ou « Library »)
Principe du clonage
organisme donneur et vecteur
-> ORGANISME DONNEUR
Purification et coupure de l’ADN en fragments (1 ou plusieurs fragments d’intérêt)
-> Insertion individuelle de chaque fragment d’ADN dans une molécule vecteur
-> VECTEUR
Transporteur d’ADN / Fragment d’ADN capable de réplication autonome
principe clonage
obtention
-> Obtention de l’ADN recombinant
Nouvelle combinaison de l’ADN d’un génome donneur avec le vecteur qui peuvent être d’origines complètement différentes
-> Transfert dans une cellule hôte
Multiplication du fragment d’ADN
quels type fragment adn
obtenu comment
- ADN génomique (séquençage complet d’un génome)
- Séquence d’intérêt dans l’ADN génomique
- Produit PCR
- ADNc après transcription inverse des ARNm
Obtention à partir d’une digestion enzymatique: - enzymes de restriction
- sauf pour insertion « ADNc entier »
propriété vecteur
- réplication active dans la cellule hôte indépendamment de l’ADN de la cellule hôte (de manière épisomale): origine de réplication
- taille compatible avec insertion de grands fragments et manipulation aisée des recombinants
- sélection des cellules qui l’ont incorporé: marqueur de sélection
- stable dans l’hôte
- sites uniques de coupure par les enzymes de restriction
- sites multiples de clonage: « polylinker »
- multiplication sans effet sur l’hôte
- purification simple
EX vecteur Plasmide
ADN circulaires extrachromosomiques (< 3Kb), réplication indépendante dans les bactéries; insert de 0.2 à 4kb (10 max). Il a :
- une orgine de replication
- un site d’insertion multiple
- des marqueurs de selection : gene LacZ et Gene de résistance a l’amplicilline
CHOIX DE LA CELLULE HÔTE
hote bacteriens
Avantages: multiplication rapide, faciles à manier, peu coûteux
E Coli = la plus utilisée
CHOIX CELLULE HOTE
hote eucaryote
Cellules de Mammifères, levures, plantes…
Intérêt pour la production de protéines devant subir des modifications post-traductionnelles (ex. glycosylations) non réalisées par les bactéries.
differente etape clonage
- Préparation du fragment d’ADN à cloner
- Préparation du fragment d’ADN et du vecteur
- Réalisation de l’ADN recombinant: insert + vecteur
- Transformation des bactéries
- Sélection des bactéries
5 bis . Sélection des bactéries : système « opéron lactose »
1ere etape clonage
preparation du fragment d’ADN a cloner
- Fragment d’ADN génomique : digestion enzymatique (enzymes de restriction) pour l’obtention du fragment d’ADN => extrêmités cohésives; digestion totale ou ménagée
- Obtention de l’ADNc par transcription inverse à partir d’ARN
- Préparation du fragment d’ADN et du vecteur
- Coupure du fragment d’ADN et du vecteur par la même enzyme : extrêmités
cohésives compatibles - Traitement du plasmide par la phosphatase alcaline :
=> Étape de déphosphorylation des extrêmités
- Transformation des bactéries
L’ADN recombinant est introduit dans les bactéries traitées spécialement le plus souvent par choc thermique ou par choc électrique (électroporation) ou par lipofection (complexe lipidique cationique = liposomes )
- Sélection des bactéries
+ systeme operon lactose
Bactéries + plasmide vide : Lac Z sans insert donc beta galactosidase active donc X gal clivé donc colonie bleu
Bactéries + plasmide recombinant :
beta galactosidase inactive donc colonie blanche
Bactéries vides => élimination par ATB (contrairement a ceux avec plasmide qui ont le gene resistant au ATB)
