METHODE D'ETUDE Flashcards
Centrifugation differentielle basse vitesse moyenne vitesse haute vitesse tres haute vitesse
–> basse vitesse (1000xg 10min)
apres le culot contient cellule entiere noyau et cytosquelette
–> moyenne vitesse (20 000xg 20min)
apres le culot contient mitochondries lysosomes et peroxysome
–> haute vitesse (80 000xg 1h)
apres le culot contient microsome petite vesicule et RER
–>tres haute vitesse (150 000xg 3h)
apres le culot contient ribosomes virus macromolecule
le surnageant a la fin contient le cytosol
Centrifugation en gradient de densite
methode de separation : substances sont concentrées dans les solutions de densite differente : fractionnement des particules en fonction de leur densite et de leur S ceux avec le plus grand S ou la plus grande densite sorte en premier
exemple separation : d lysosome < d mitochondrie < d peroxysome
+ important a connaitre pour faire chromatographie
+ une prot possede groupement polaire + elle est soluble dans l’eau
+ elle posssede de groupement apolaire + elle est soluble dans les solvants organique
les prot sortent en sens inverse de leur affinité pour la résine (matrice). Si prot tres forte affinité avec matrice : dur a décrocher
Chromatographie de partage
partage en phase normal :
partage en phase inverse :
avec une phase stationnaire liquide
partage en phase normal : si la phase stationnaire est hydrophile alors compose hydrophobe sont éluées en premier et les hydrophile en dernier
partage en phase inverse : si la phase stationnaire est hydrophobe alors compose hydrophile sont éluées en premier et les hydrophobe en dernier
Chromatographie d’exclusion stérique ( ou exclusion-diff ou filtration sur gel )
Les grosses molecules sont éluées en premier et les petites en dernier
Chromatographie echangeuse d’ion
Resine echangeuse d’anions (cationique) = chargée + pour retinir les anions chargés -
Resine echangeuse de cation (anionique) = chargée - pour retinir les cations chargés +
Chromatographie d’affinité :
séparation des constituants en fonction de leur affinite avec le ligand fixé à la matrice
Électrophorèse
condition denaturant
condition reductrice
pour determiner la taille et masse monomere ou dimere ou proteine
Va du moins vers le plus et les plus grand et gros reste en haut et le plus petit descende
condition denaturant : SDS coupent tout sauf pont disulfure
condition reductrice : beta mercato ethanol coupent pont disulfure
Spectro de Masse
en tandem
permet de separe les AA en fonctions de leur masse et de leur charge grace a un aimant
Les plus lourd ne seront pas devie et les plus leger seront le plus devie
Les premiers dans le detecteur seront les plus gros
calcul du rapport masse/charge
approche qualitative ou semi-quantitative , puis quantitative apres comparaison a des etalons et établissement d’une courbe de calibration
en tandem : on fait spectro 2x on obtient (MS/MS) => identifier le peptide coupe en dernier puis avant dernier etc
Maldi Tof
pour echantillon fragile : bombarde directement l’echantillon initial on le fixe sur une matrice qui va subir l’action d’une source laser : desoprtion de la matrice qui en se decalant entraine des ions
reaction d’edman
sequencage en N-ter d’un peptide, clive le premier AA (va se fixer au premier amine) et on obtient le PTH-AA
clivage en peptide
hydrolyse chimique par bromure de cyanogène
hydrolyse enzymatique (endoprotease) trypsine, pepsine, chymotrypsine
bromure de cyanogène : clive methionine du cote c-ter
trypsine : Lys, Arg sauf si pro a droite en C-ter
pepsine : Phe, Trp, Tyr, Leu sauf si Pro a gauche en N-ter
Chymotrypsine : Phe, Trp, Tyr, Leu sauf si Pro a droite en C-ter
