Pharmacologie : CM8 Flashcards
Comment réalise-t-on les études de liaison au récepteurs des ligands radioactifs ?
4 étapes :
* Incubation Lg et Rc/ en filtrant →
* Séparation (on sépare les récepteurs= grosses molécules et ligands
= petite molécules, et on filtre pour éliminer les ligands libres)
* mesure de la radioactivité du complexe, de la C° Lg/Rc et donc savoir cb il y a de Rc
* lecture
Protocole expérimental des expériences de saturation ?
Lg* à dose croissante dans un tube avec les Rc et on mesure la radioactivité, plus on
met de Lg, plus il y a d’activité et plus il y a de radioactivité mesure de la fixation sur le Rc
Comment se font les mesure de liaison totale et non spécifique ?
Nécessite 2 expériences :
- Liaison totale
- Liaison non spécifique
Comment se fait l’expérience de mesure de la liaison non-spécifique ?
On ajoute une forte C° fixe de ligand non marqué
→ Il faut que le ligand non marqué ait une affinité pour le récepteur d’intérêt afin qu’il s’y fixe à la place du ligand radioactif
Objectifs des études de liaisons ?
Permet de sélectionner un candidat médicament
Comment étudier les liaisons ?
Calculant :
- Affinité du ligand KD ⇨Comparaison des PA
- Densité des récepteurs = Bmax
Quels sont les principes fondamentaux des récepteurs ?
- Plusieurs types de récepteurs sur une même C
- Quantité et fonctionnalité des récepteurs va varier selon certaines conditions :
- Pathologies
- Traitement médicamenteux chronique
Quels sont les critères d’identification des récepteurs ?
- Liaisons Ligands / Récepteurs sont
- Réversibles : les liaisons des molécules sur les récepteurs se font et se défont selon une certaine affinité (Kd)
- Saturables : le nb de sites de liaison est limité (Bmax)
- Les récepteurs sont stéréospécifique
Quels sont les types d’interaction ligand/récepteurs ?
- Hormones/facteurs de croissances : grande affinité car C° de l’hormone très faible, ordre du nM
- Neurotransmetteurs : faible affinité car C° très élevée, ordre du mM
Caractéristiques de la courbe de liaison totale ?
Lors de la mise en contact avec le ligand :
* fixation sur le récepteur
* fixation sur d’autres structures de nature protéique, lipidique,… ⇨ parasitent la liaison au récepteur (sélective)
Caractéristiques de la courbe de liaison non-spécifique ?
Liaison non saturable i.e. elle augmente avec la [ligand] de façon linéaire
/!\ ON NE PEUT PAS LA SUPPRIMER TOTALEMENT /!\
Qu’est-ce que la liaison sélective ?
Liaison sélective = Liaison totale – Liaison non spécifique
A partir de quelle courbe calcule-t-on le KD ?
Calculé à partir de la liaison spécifique i.e. sur récepteur
Qu’est-ce que le KD ?
- C° correspondant à 50% de liaison spécifique au récepteur
- lecture possible à partir de la courbe de liaison spécifique (pas très précis) : meilleur avec échelle log
- calcul possible à partir de l’équation de la droite (représentation de scatchard) la + utilisée
Equation de Scarchard ?
B / F = -1/ KD* B + (Bmax)/KD
Relation entre le KD et l’affinité d’un ligand pour son récepeteur ?
+ KD est faible + affinité de L pour R est forte
Intérêt du KD en pharmacologie ?
=> Permet la classification des L et des R
* Intérêt pour le dvlpt des médicaments => détection de nvx ligands => sélectivité d’action
* Etude de la fixation d’un nouveau ligand => prédiction du profil pharmacologique => sélection des substances médicamenteuses en fonction d’un objectif donné
Intérêt du Bmax en pharmacologie ?
- Ttt médical par les β‐bloquants:
- ↗ Bmax 3 semaines après
⇨ ↗ densité des R
⇨ hypersensibilité aux catécholamines
- ↗ Bmax 3 semaines après
- Si arrêt du ttt du jour au lendemain: catécholamines activent les R qui sont plus nombreux
⇨ ↗ effet catécholamines au niveau myocardique
⇨ troubles du rythme cardiaque
Intérêt de la représentation de Hill ?
Illustre les résultats des expériences de liaison spécifique dans le but de quantifier la déviation éventuelle de l’interaction ligand-récepteur de la loi d’action de masse
Equation de la courbe de saturation avec la représentation de Hill ?
Log [LR / Bmax–LR] = nHlog L* -log KD
A quoi correspond la pente de la droite de Hill ?
Aux nb de sites de liaison du L par R
= nombre de Hill ou nH
A quoi correspond le nb de Hill ?
A la stœchiométrie de l’interaction L-R
Que signifie nH = 1 ?
= Loi d’action de masse respectée
* Liaison LR considérée comme spécifique :
1 molécule L se lie à 1 molécule R => population homogène de récepteurs
Que signifie nH < 1 ?
=> Coopérativité négative
* Théoriquement : - d’1 site de liaison par molécule de R !
* plusieurs sites d’affinités différentes
ou plusieurs R d’affinité proche pour le L ou un même récepteur sous 2 conformations différentes
=> Il faut alors définir l’affinité de chaque site
Que signifie nH > 1 ?
=> Coopérativité positive
Il y a théoriquement + d’un site de liaison par molécule de récepteur
Que permettent de calculer les expériences de déplacement de la liaison à l’équilibre ou de compétition ?
Calcul de la CI50 et du Ki
Principe des expériences de déplacement de la liaison à l’équilibre ou de compétition ?
Mesurer la liaison spécifique à l’équilibre d’une concentration donnée de ligand radioactif en présence de concentrations variables et croissantes de
ligand non radioactif
Comment se fait la réalisation pratique des études de déplacements ?
Réalise une série de tubes dans lesquels on a :
- Le récepteur R à C° fixe
- Le ligand marqué L* à C° fixe
- Le ligand non marqué L en C° croissante = compétiteur
Comment déterminer le CI50 ?
Expérimentalement on détermine une CI50 = concentration de ligand non marqué déplaçant 50% de radioligand de ses sites de liaison
Relation entre CI50 et l’affinité ?
+ CI50 faible + affinité forte
Equation de Chenf et Prussoff ?
Voire diapo CM8 page 35
Relation entre Ki et affinité ?
+ Ki est faible + affinité est forte
Caractéristiques d’une représentation de Hill d’une courbe de déplacement (ou compétition) ?
En ordonnées : Liaison en présence de compétiteurs est
exprimé en %Bmax
Pente = nH
Problématiques liées au Ki et KD ?
Renseignent sur l’interaction L-R MAIS PAS sur la réponse physiologique due à la liaison du ligand
