PCR och Realtids PCR Flashcards
Vad är principen hos PCR? (Vilka viktiga steg ingår)
- Dela upp DNA-sträng
- Inbindning av primers
- DNA-syntes
- Exponentiell amplifiering (teoretiskt dubblas mängden målsekvens efter varje cykel)
Vad är fördelarna med manuell extraktion jmf med automatiserad?
Manuell har ofta bättre prestanda, anpassad storlek på nukleinsyran
Automatiserad är mer jämförbar, tidsbevarande och har större kapacitet
DNA är polärt vilket innebär?
Lösligt i vatten, vatten är polärt. “lika löser lika”
Denna egenskap utnyttjas vid extraktion
Vad finns det för olika extraktionsmetoder för DNA/RNA
- Solid phase (-magnetkulor, silica, membran) (-manuellt (kolonn) eller maskinellt
- Oorganisk metod: detergenter (SDS), EDTA, proteinfällning, DNA fällning
- Organisk metod: fenol/kloroform, högt utbyte av DNA
Beskriv händelseförloppet för solid phase extraktion
sample –> lysis –> binding –> washing –> elution –> pure DNA/RNA
Vad kan inhibitorer göra? (PCR)
interagerar med DNA, interfererar med DNA-polymeras, påverkar CO-faktorer = prestanden på PCR blir inte lika bra. Vanligen lyckas man rena bort inhibitorer.
Kan undkomma extraktion genom att binda till DNA
Om man får oväntade svar av PCR kan det bero på inhibitorer
Vad är skillnaden på manuell vs automatiserad extraktion?
Manuell
- Oftast bättre prestande, anpassad storlek på nukleinsyra
- tidskrävande
- mindre flöde av prover
- beroende av utförare
Automatiserad
- Mindre variabillitet, jämn prestanda
- tidsbesparande
- större kapacitet
- Ej beroende av utförare (i samma utsträckning)
Ge exempel på inhibitorer
Salter, detergenter, immunoglobulin, hemoglobin, urea, syror, humant DNA
Vad är DNA (eller RNA)- templat?
Renad nukleinsyra fri från inhibitorer som kan användas som mall i PCR-reaktionen
Vad ska man tänka på när man konstruerar primers?
- GC innehållet (max 60%)
- undvik långa sträckor av en enda nukleotid
- Tm-värdet (likvärdiga för FP och RP)
- Undvik att primrarna är komplementära med sig själva eller med varandra
Vill ha en primer som är så lik bakterien som möjligt. Söker man något specifikt vill man kanske inte ha något som är så likt.
Vad är tumregeln för annealingtemperaturen?
Tm = 2(A+T)+4(G+C)
Starta med en temperatur som är 5 grader lägre än primrarnas smälttemperatur
Vilka är byggstenarna för kopiering?
Oligonukleotider
Vad gör DNA polymeras?
Påskyndar sammanfogningen av dNTP (påskyndar kopieringen)
Vad innehåller bufferten?
MgCl2 och andra salter (salterna beror på vilket DNA polymeras som ska användas)
Vad är ett värmeblock?
Instrument som kan skifta mellan temperaturer
Vad händer i en PCR?
- Vi söker efter “Target DNA”, när vi höjer till 95° separeras DNA strängarna, när vi sänker temperaturen binder primrarna in. Vid 72° binder oligonukleotiderna in och kopierar
- Upprepas flertalet gånger för fler kopior
- Vid cykel 29 har vi fått flera miljoner kopior av den målstruktur som vi söker
- Söker man ett virus finns det kanske inte i alla celler = blir då inte lika många kopior
Vad står RT för i RT-PCR?
Reverse transcriptase
Vad är RT-PCR?
vad händer?
Används om man söker efter RNA
- RNA omvandlas till cDNA med hjälp av enzymet reverse transcriptase
- Specifika primers, oligo(dT)s, random primers
- NDA-RNA hybrid
- RNA bryts ner enzymatiskt
- ssDNA komplementärt till det ursprungliga RNAt
Ge tre exempel på hur detektion av det amplifierade materialet kan ske
- Gelelektrofores, agaros
- Infärgning av DNA
- EtidiumBromid, Gel Red, Sybrgreen
Beskriv NESTAD PCR
- Primers innanför det första paret med primära
- Ny PCR reaktion från produkten i den första PCR reaktionen
- Ökad specificitet
- kontaminationsrisk
qPCR betyder?
Realtids PCR
kännetecken hos qPCR
- Amplifieringen av DNA kan följas i realtid
- Man “fångar” PCR-amplifieringen i den exponentiella fasen
Nämn skillnader hos qPCR mot PCR
- Prober eller SYBR Green
- Detektion av amplifiering i varje cykel
- Kvantitativ eller kvalitativ
- Slutet system
Vad är SYBR Green?
DNA-bindande molekyler (hybridisation probes)
