PCR och Realtids PCR

Question 1

Vad är principen hos PCR? (Vilka viktiga steg ingår)

Answer 1

• Dela upp DNA-sträng
• Inbindning av primers
• DNA-syntes
• Exponentiell amplifiering (teoretiskt dubblas mängden målsekvens efter varje cykel)

Question 2

Vad är fördelarna med manuell extraktion jmf med automatiserad?

Answer 2

Manuell har ofta bättre prestanda, anpassad storlek på nukleinsyran

Automatiserad är mer jämförbar, tidsbevarande och har större kapacitet

Question 3

DNA är polärt vilket innebär?

Answer 3

Lösligt i vatten, vatten är polärt. “lika löser lika”

Denna egenskap utnyttjas vid extraktion

Question 4

Vad finns det för olika extraktionsmetoder för DNA/RNA

Answer 4

• Solid phase (-magnetkulor, silica, membran) (-manuellt (kolonn) eller maskinellt
• Oorganisk metod: detergenter (SDS), EDTA, proteinfällning, DNA fällning
• Organisk metod: fenol/kloroform, högt utbyte av DNA

Question 5

Beskriv händelseförloppet för solid phase extraktion

Answer 5

sample –> lysis –> binding –> washing –> elution –> pure DNA/RNA

Question 6

Vad kan inhibitorer göra? (PCR)

Answer 6

interagerar med DNA, interfererar med DNA-polymeras, påverkar CO-faktorer = prestanden på PCR blir inte lika bra. Vanligen lyckas man rena bort inhibitorer.

Kan undkomma extraktion genom att binda till DNA

Om man får oväntade svar av PCR kan det bero på inhibitorer

Question 7

Vad är skillnaden på manuell vs automatiserad extraktion?

Answer 7

Manuell

• Oftast bättre prestande, anpassad storlek på nukleinsyra
• tidskrävande
• mindre flöde av prover
• beroende av utförare

Automatiserad

• Mindre variabillitet, jämn prestanda
• tidsbesparande
• större kapacitet
• Ej beroende av utförare (i samma utsträckning)

Question 8

Ge exempel på inhibitorer

Answer 8

Salter, detergenter, immunoglobulin, hemoglobin, urea, syror, humant DNA

Question 9

Vad är DNA (eller RNA)- templat?

Answer 9

Renad nukleinsyra fri från inhibitorer som kan användas som mall i PCR-reaktionen

Question 10

Vad ska man tänka på när man konstruerar primers?

Answer 10

• GC innehållet (max 60%)
• undvik långa sträckor av en enda nukleotid
• Tm-värdet (likvärdiga för FP och RP)
• Undvik att primrarna är komplementära med sig själva eller med varandra

Vill ha en primer som är så lik bakterien som möjligt. Söker man något specifikt vill man kanske inte ha något som är så likt.

Question 11

Vad är tumregeln för annealingtemperaturen?

Answer 11

Tm = 2(A+T)+4(G+C)

Starta med en temperatur som är 5 grader lägre än primrarnas smälttemperatur

Question 12

Vilka är byggstenarna för kopiering?

Answer 12

Oligonukleotider

Question 13

Vad gör DNA polymeras?

Answer 13

Påskyndar sammanfogningen av dNTP (påskyndar kopieringen)

Question 14

Vad innehåller bufferten?

Answer 14

MgCl2 och andra salter (salterna beror på vilket DNA polymeras som ska användas)

Question 15

Vad är ett värmeblock?

Answer 15

Instrument som kan skifta mellan temperaturer

Question 16

Vad händer i en PCR?

Answer 16

• Vi söker efter “Target DNA”, när vi höjer till 95° separeras DNA strängarna, när vi sänker temperaturen binder primrarna in. Vid 72° binder oligonukleotiderna in och kopierar
• Upprepas flertalet gånger för fler kopior
• Vid cykel 29 har vi fått flera miljoner kopior av den målstruktur som vi söker
• Söker man ett virus finns det kanske inte i alla celler = blir då inte lika många kopior

Question 17

Vad står RT för i RT-PCR?

Answer 17

Reverse transcriptase

Question 18

Vad är RT-PCR?

vad händer?

Answer 18

Används om man söker efter RNA

• RNA omvandlas till cDNA med hjälp av enzymet reverse transcriptase
• Specifika primers, oligo(dT)s, random primers
• NDA-RNA hybrid
• RNA bryts ner enzymatiskt
• ssDNA komplementärt till det ursprungliga RNAt

Question 19

Ge tre exempel på hur detektion av det amplifierade materialet kan ske

Answer 19

• Gelelektrofores, agaros
• Infärgning av DNA
• EtidiumBromid, Gel Red, Sybrgreen

Question 20

Beskriv NESTAD PCR

Answer 20

• Primers innanför det första paret med primära
• Ny PCR reaktion från produkten i den första PCR reaktionen
• Ökad specificitet
• kontaminationsrisk

Question 21

qPCR betyder?

Answer 21

Realtids PCR

Question 22

kännetecken hos qPCR

Answer 22

• Amplifieringen av DNA kan följas i realtid

- Man “fångar” PCR-amplifieringen i den exponentiella fasen

Question 23

Nämn skillnader hos qPCR mot PCR

Answer 23

• Prober eller SYBR Green
• Detektion av amplifiering i varje cykel
• Kvantitativ eller kvalitativ
• Slutet system

Question 24

Vad är SYBR Green?

Answer 24

DNA-bindande molekyler (hybridisation probes)

Question 25

Vad innehåller proben i qPCR?

Answer 25

5´Reporter och 3´Quencher

Question 26

Vad hör 3´quenchern?

Answer 26

Quenchern släcker vanligtvis färgen hos proben men om man har “rätt” primer binder den in till proben och då frigörs 5´ vilken avger färg.

Question 27

När sker elongeringen i qPCR?

Answer 27

I varje cykel när det går från 58° till 95°

Question 28

Vad är Cq/Ct?

Answer 28

Threshold linje

Placeras där den exponentiella fasen börjar i grafen

Question 29

Vad är Multiplex QPCR/RT-QPCR?

Answer 29

• Prober med olika fluorescerande molekyler

- Flera primer/probe system I samma PCR-reaktion

Question 30

Vad står q för i qPCR?

Answer 30

KVANTIFIERING

• Kvantifiering med realtids-PCR (relativ eller absolut)

Question 31

Vad är skillnaden på en 1-steg och 2-stegs reaktion hos RT-qPCR (letar efter RNA)?

Answer 31

2 steg: Först gör man sin lösning och sedan utförs PCR

1 steg: Allt (i 2 steg) görs på samma gång

Question 32

Vad kan problem som uppkommer med qPCR bero på?

Answer 32

• Primer design
• Primerkoncentration
• Annealingtemperatur
• MgCl2 koncentration
• Sekundärstrukturer

Question 33

Vad finns det för fördelar med qPCR?

Answer 33

• Högre specificitet (probe)
• Mindre risk för kontamination (slutet system)
• Möjlighet att kvantifiera
• “synlig” reaktion
• Tidseffektiv

Question 34

Vad finns det för tillämpningar för qPCR?

Answer 34

• Diagnostik av genetiska sjukdomar
• Diagnostik av cancersjukdomar
• Diagnostik av virussjukdomar
• Diagnostik av bakterieinfektioner
• Preimplantationsdiagnostik vid provrörsbefruktning
• Rättsmedicin (faderskapsmål, brottsmål)
• Läkemedelsindustrin
• Arkeologi
• Växt och jordbruksforskning
• Medicinforskning (kloning, sekvensering….)

Question 35

Vad är Digital droplet PCR (DDPCER)?

Answer 35

• Absolut kvantifiering (utan standardkurva)
• Upp till 96 prov per körning
• Prov, PCR reagens och olja blandas
• Droppar genereras
• 20 000 PCR-reaktioner per prov/ varje droppe
• Dropparna fluorescerar och detta mäts i en flödescell