Cellanalys - introduktion

Question 1

Vad innebär en primär immunbristsjukdom? Ge ett exempel

Answer 1

En medfödd genetisk sjukdom som orsakas av att någon komponent i immunsystemet saknas/inte fungerar. Tex Kronisk granulomatös sjukdom (CGD)

Question 2

Vad innebär en sekundär immunbristsjukdom? Ge ett exempel

Answer 2

Immunbristsjukdom som förvärvats under livet. Tex AIDS

Question 3

Vad innebär en autoimmun sjukdom? Ge ett exempel

Answer 3

En sjukdom som orsakas av att immunsystemet aktiveras av och reagerar mot kroppens egna molekyler. Tex MS, Graves sjukdom, SLE

Question 4

Vad är ett autoantigen?

Answer 4

Även kallat ett självantigen. En av kroppens egna molekyler som immunsystemet reagerar mot vid autoimmun sjukdom

Question 5

Vad innebär allergi?

Answer 5

Ett tillstånd orsakat av att immunsystemet aktiveras av, och reagerar mot, ofarliga molekyler i omgivningen eller födan (allergener)

Question 6

Vad är immunoassay? Vilken princip använder den?

Answer 6

En laboratoriemetod som används för att detektera eller kvantifiera en molekyl med hjälp av den specifika bindningen mellan antikropp och antigen

Question 7

Vilka immunologiska metoder kan detekteras mha synen?

Answer 7

Agglutinationstest (bygger på agglutination) och immunodiffusion (bygger på precipitation/utfällning)

Question 8

Vilka immunologiska metoder kräver maskiner för detektion? Vilka principer bygger de på?

Answer 8

• Turbidimetri, nefelometri - bygger på ljusspridning

Detektion mha antikropp/antigen märkt med detektionsmolekyl:

• ELISA, ELISPOT - enzym som detektionsmolekyl
• RIA - radioaktiv isotop som detektionsmolekyl
• FACS, immunfluorescens - fluorokrom som detektionsmolekyl
• CLIA - kemiluminescent tags som detektionsmolekyl

Question 9

Vad används cellanalyser för inom klinisk immunologi? Ge exempel på några celler som kan analyseras

Answer 9

Används ffa för diagnos av immunbristtillstånd och uppföljning av patienter som genomgår immunterapi, men även för diagnostik av överaktivitet i immunsystemet (autoimmunitet, allergi)

Tex fagocyter, lymfocyter, B-celler, T-celler

Question 10

Vilka vävnadsprover används för analys av immunceller?

Answer 10

Ffa i blodprover, men ibland även i CSF, BAL, och vävnadsextrakt

Question 11

Hur prepareras blodproverna för cellanalys?

Answer 11

Ofta separeras immuncellerna från blodkropparna först,

• Densitetsgradientcentrifugering (lymfoprep, ficoll)
• Osmotisk lysering av röda blodkroppar (tex mha ammoniumklorid)

Question 12

Hur går Densitetsgradientcentrifugering till?

Answer 12

1. Till blodprovet tillsätts NaCl
2. I ett separat rör tillsätts ficoll/lymfoprep, en tjock och seg vätska
3. Blod-NaCl-blandningen tillsätts till röret försiktigt så det inte blandas
4. Centrifugering
5. Röda blodkroppar och granulocyter hamnar i botten, medan PBMC (peripheral blood mononuclear cells) hamnar överst
6. PBMC cellskiktet sugs av och är redo för analys

Question 13

Vad står PBMC för? Vilka celler ingår?

Answer 13

Peripheral blood mononuclear cells

Lymfocyter + monocyter

Question 14

Varför vill man ta bort neutrofilerna vid densitetsgradientcentrifugering?

Answer 14

För de kan släppa ut farliga ämnen som skadar de andra cellerna

Question 15

Hur kan rena cellpopulationer (tex endast T-celler) isoleras från PBMC?

Answer 15

Olika celltyper kan isoleras mha monoklonala antikroppar mot unika cellytemolekyler som uttrycks av respektive celltyp.

Dessa märks/binds med olika molekyler med egenskaper som kan användas för separation (tex fluorokromer - FACS, magnetkulor)

Question 16

Vilka unika cellytemolekyler har de olika celltyperna (T-, B-celler och monocyter)?

Answer 16

T-celler: CD3
B-celler: CD19, CD20
Monocyter: CD14

Question 17

Hur går isolering med magnetiska kulor till?

Answer 17

1. Monoklonala antikroppar kopplas till magnetiska kulor, AK binder till den valda celltypen
2. Blandningen sätts i ett rör med öppning i botten, med magnet runt
3. De inmärkta cellerna hålls fast av magnetfältet medan de omärkta cellerna åker ut ur öppningen ner i ett rör under
4. Ett nytt rör sätts under och magneten tas bort, de inmärkta cellerna släpps ut

Question 18

Vilka två typer/indelningar av cellanalyser finns det?

Answer 18

Fenotypiska cellanalyser: “hur ser celltypen ut och hur många celler finns det som ser ut så?”

Funktionella cellanalyser: “Hur fungerar celltypen”

Question 19

Ge exempel på några frågor som kan besvaras av fenotypiska cellanalyser?

Answer 19

• Hur många T-celler, B-celler och NK-celler finns det per ml i ett blodprov?
• Är T-cellerna aktiverade (uttrycker de aktiveringsmarkörer)?
• Vandrar T-cellerna till lymfknuta (uttrycker de vissa homingreceptorer)?

Question 20

Vilken är den typiska analysmetoden/testet som används vid fenotypiska cellanalyser?

Answer 20

Flödescytometri

Question 21

Ge exempel på några frågor som kan besvaras av funktionella cellanalyser?

Answer 21

• Kan fagocyter fagocytera på ett normalt sätt?
• Kan T-cellerna dela sig på normalt sätt?
• Kan B-cellerna producera antikroppar på ett normalt sätt?

Question 22

Efter stimulering av helblod eller isolerade immunceller genomförts, vilka analysmetoder/tester är vanliga vid funktionella cellanalyser?

Answer 22

Flödescytometri, radioaktivitet, ELISPOT

Question 23

Ge exempel på stimuli som aktiverar många/alla monocyter/makrofager

Answer 23

TLR-ligander - tex LPS, CpG DNA

Question 24

Ge exempel på stimuli som aktiverar många/alla B-celler

Answer 24

Lektiner (PWM tex), Epstein-Barr Virus

Question 25

Ge exempel på stimuli som aktiverar många/alla T-celler

Answer 25

Lektiner (PHA tex), anti-CD3-antikroppar

Question 26

Ge exempel på specifika antigen som kan aktivera T-celler specifikt via T-cellsreceptorn

Answer 26

Stelkrampstoxoid, peptider från cytomegalovirus (de flesta personer har CMV latent), influensavirus

Question 27

Vad är en lektin? Hur funkar de?

Answer 27

Kolhydratbindande protein som korsbinder kolhydrater på immuncellernas ytaoch därmed aktiverar dem och får dem att börja dela sig

Question 28

Hur sker celldelningsanalys av T-celler genom inkorporering av radioaktivt tymidin? Vad kan det ge mått på?

Answer 28

``` PBMCs tillsätts i brunnar (lika många i varje). Olika saker tillsätts till dem: Brunn 1: negativ kontroll Brunn 2: Antigen A Brunn 3: Antigen B Brunn 4: positiv kontroll (lektin) ``` Efter 3-5 dagar undersöks tillväxten. Cellerna delar sig endast om man har minnesceller mot antigenet. Radioaktivt thymidin inkorporeras ENDAST i prolifererande celler. Obundet thymidin tvättas bort, sedan mäts radioaktiviteten hos cellerna. Man får endast utslag hos de celler som delat sig och man kan därmed få ett mått på celldelningsförmågan hos T-cellerna.

Question 29

Vad står ELISPOT för?

Answer 29

EnzymeLinked ImmunoSPOT

Question 30

Vad är principen för ELISPOT?

Answer 30

Samma princip som Sandwich eller indirekt ELISA, men istället för att mäta absorbans i en lösning räknas färgprickar (spots) på ett membran

Question 31

Vad analyseras vid ELISPOT?

Answer 31

Förmågan hos celler att producera ett visst protein. En spot = en cell som producerar det eftersökta proteinet

Question 32

Vad kan detekteras vid ELISPOT?

Answer 32

- Samtliga celler som producerar ett visst protein - Antigenspecifika T-celler (cytokinproduktion analyseras) - Antigenspecifika B-celler (antikroppsproduktion analyseras)

Question 33

Vilka är de viktiga stegen i ELISPOT när man analyserar antikroppsproducerande celler?

Answer 33

1. Tag blodprov och isolera PBMCs med densitetsgradientcentrifugering 2. Sätt PBMC i olika brunnar på cellodlingsplatta 3. Stimulera några brunnar, lämna några ostimulerade, inkubera några dagar 4. Skörda, räkna och späd cellerna till olika koncentrationer och flytta dem sedan till en platta coatad med anti immunoglobulin-antikropp 5. Tvätta bort cellerna, tillsätt detektionsantikroppar (inkubera över natt, tvätta 6. Tillsätt extravidin, tvätta, tillsätt enzymsubstrat, tvätta 7. Räkna spots = antalet celler som producerar IgG/A/M (vilken man nu valt att undersöka)

Question 34

Varför späder man cellerna vid ELISPOT?

Answer 34

För att man inte vet hur mycket antikroppar/annat som cellerna kommer producera och man vill hitta en lämplig spädning där man kan räkna prickarna enkelt

Question 35

Beskriv metodprincipen/stegen för ELISPOT vid analys av cytokinproducerande celler

Answer 35

1. Capture-antikroppar sätts i botten på brunnen 2. Stimulering av PBMCs med antigen så att cytokinerna börjar produceras och fångas av antikropparna 3. Tvätt + tillsats av detektionsantikropp konjugerad med biotin 4. Tillsats av streptavidinkonjugerad ALP 5. Tillsats av kromogensubstrat

Question 36

Ge exempel på ELISPOT-analyser samt vad plattorna coatas med för varje analys

Answer 36

- Analys av antal immunoglobulinproducerande B-celler i ett prov (diagnostik av patienter med B-cellsdefekter). Platta coatad med anti IgG/A/M - Analys av antal B-celler som producerar antikroppar specifika för mikroorganismer/vaccin för diagnostik av patienter med B-cellsdefekter. Platta coatad med vaccinantigen - Analys av antal T-celler som producerar en viss cytokin (tex INF-gamma) för diagnostik av patienter med immundefekter. Platta coatad med anti-INF-gamma-antikroppar

Question 37

Vilka skillnader finns mellan ELISA och ELISPOT?

Answer 37

I ELISA mäter man koncentrationen av AK/proteiner i en lösning. Enhet: titer eller pg/ml vs I ELISPOT mäter man antalet celler som producerar AK/protein i ett prov ELISA är mindre komplicerad och lättare att standardisera och robotisera än ELISPOT ELISPOT är en mkt känslig metod som används mycket inom forskning och för vissa kliniska analyser vs ELISA används flitigt inom både diagnostik och forskning