Cellanalys - flödescytometri Flashcards
Vad är flödescytometri?
En automatiserad analys av flera egenskaper samtidigt hos enskilda celler/partiklar i vätskelösning. tex immunceller, plastkulor, bakterier
Mycket användbar metod för att kunna särskilja olika immunceller från varandra och för att studera deras egenskaper och funktion
Vad används flödescytometri ffa för inom klinisk immunologi?
Analys av immunceller, men även för koncentrationsbestämning av proteiner i lösning
I en mening, hur analyseras cellerna/partiklarna i flödescytometern?
De analyseras individuellt med avseende på ljusspridning och fluorescens
Vad för antikroppar används vid flödescytometri?
Fluorokrominmärkta antikroppar specifika för ytmolekyler som särskiljer olika immunceller från varandra
På vilka två olika sätt kan flödescytometri användas för celler/partiklar?
För att analysera (vanligast) och sortera celler och partiklar
Vad står FACS för?
Fluorescence Activated Cell Sorting
Hur fungerar en fluorokrom?
Energi tillförs till ett ämne tex genom laserstrålar vilket får ämnets elektroner att exciteras till en högre energinivå. När elektronen går tillbaka till sin “ground state” emitteras energin som fluorescens. Det emitterade ljuset har annan våglängd än det som användes för excitation.
Vilka två sorters cellmarkörer finns?
Ytmarkörer och intracellulära markörer
Ge några exempel på ytmarkörer
- Lineage markers: CD3, CD4, CD8
- Aktiveringsmarkörer: CD69, CD154
- Homingreceptorer: CD62L (L-selektin), Alfa-4-beta-7
Ge några exempel på intracellulära markörer
- Lineage markers: FOXP3 (Treg), T-bet (Th1), ROR-gamma-t (Th17)
- Celldelningsmarkörer: Ki57, BrdU, CFSE
- Funktionella markörer: Cytokiner och cytotoxiska effektormolekyler
Vad är syftet med att analysera olika kombinationer av cellmarkörer samtidigt? Vad krävs för att det ska funka?
Syftet: gör det möjligt att analysera olika celltyper och deras funktion samtidigt
För att det ska funka krävs att man använder flera olika antikroppar märkta med olika fluorokromer samtidigt
Beskriv arbetsflödet för flödescytometrin
1: Förberedelse av provet (helblod eller PBMCs)
2: Färgning samt tillsats av specifika fluorokrommärkta antikroppar. För intracellulär färgning måste cellmembranet permeabiliseras med detergent.
3: Eventuell lysering av röda blodkroppar (endast för helblodsprover)
4: Injektion i flödescytometern, analys av cellerna mha laser och detektorer
5: Dataanalys
Hur många färger kan de flödescytometrar analysera som används kliniskt på SU?
8-10 olika fluorokromer/färger
Vilka tre delar består flödescytometern av?
- Flödessystem - för provet genom maskinen i vätskedröm
- Optik - exciterar fluorokromer (laser) och samlar in ljus (detektorer)
- Elektronik - omvandlar ljus till digital information och siffror
Beskriv metodprincipen för flödescytometrin
- Celler med fluorokrominmärkta antikroppar (i detta exempel anti-CD8: blå och anti-CD4: röd) förs in i flödescellen
- Cellerna passerar genom flödescellen och lasern en och en
- Laserljuset fokuseras mha linser och prismor mot cellen och träffar en cell i taget. Det emitterade ljuset förs från cellen, styrs och filtreras mha linser, speglar och filter till detektorer och vidare till datasystemet
Vad säger “forward scatter” om cellen? Påverkas det av fluorescensen?
Forward scatter reflekterar storleken hos cellen. Påverkas ej av fluorescensen
Vad säger “side scatter” om cellen? Hur fungerar det?
Side scatter reflekterar granulariteten hos cellen. Mer granulära celler sprider ljuset på ett visst sätt, det är ej fluorescens
Vad reflekterar fluorescensintensiteten?
Hur många fluorokrommärkta antikroppar som bundit till cellen
Hur går “gating” till vid dataanalysen av dot plots?
Man “sätter staket” runt olika “cellpopulationer” i diagrammen
Vilka typer av dot plots finns? Hur många parametrar analyserar de?
Vanlig dot plot, pseudo colour plot och contour plot
2 parametrar???
Vilka två kategorier av diagram finns? Hur många parametrar analyserar de? Vad visar de?
Histogram - analyserar en parameter. Är som ett stapeldiagram över antal celler med viss signalstyrka.
Dot plot - analyserar två parametrar i ett koordinatsystem. En prick = en cell
Vilka är de huvudsakliga stegen i flödescytometrisk dataanalys?
- Analys av forward och side scatter
- Identifiera den huvudpopulation av celler du vill analysera (tex lymfocyter)
- Sätt en gate runt celltypen
- Fortsätt att analysera endast den utvalda cellpopulationen med avseende på bindning av fluorokrommärkta antikroppar
Vid flödescytometrisk analys får man vanligtvis fram frekvensen av celler av en viss undertyp i en cellpopulation - varför inte koncentrationen? Hur kan man komma runt detta?
Flödescytometrar är dåliga på att mäta vilken volym prov som analyserats, men de är mycket bättre på att räkna antal celler.
Om man tillsätter små plastkulor i en känd mängd till provet (tex 100/ml) så kan man sedan se hur många kulor som detekterats och därmed veta hur mycket av provet som analyserats (tex 50 kulor = 0,5ml). Sedan relateras detta till antalet detekterade celler (100 000 celler i 0,5ml –> 200 000 celler/ml)
Vad är principen för fagocytostest?
Man testar neutrofiler och monocyters fagocyteringsförmåga genom att utsätta dem för fluorescensinmärkta + opsoniserade E. coli. Sedan mäts mängden celler som fluorescerar, sk FITC+ celler, mha FACS
