Cellanalys - flödescytometri

Question 1

Vad är flödescytometri?

Answer 1

En automatiserad analys av flera egenskaper samtidigt hos enskilda celler/partiklar i vätskelösning. tex immunceller, plastkulor, bakterier

Mycket användbar metod för att kunna särskilja olika immunceller från varandra och för att studera deras egenskaper och funktion

Question 2

Vad används flödescytometri ffa för inom klinisk immunologi?

Answer 2

Analys av immunceller, men även för koncentrationsbestämning av proteiner i lösning

Question 3

I en mening, hur analyseras cellerna/partiklarna i flödescytometern?

Answer 3

De analyseras individuellt med avseende på ljusspridning och fluorescens

Question 4

Vad för antikroppar används vid flödescytometri?

Answer 4

Fluorokrominmärkta antikroppar specifika för ytmolekyler som särskiljer olika immunceller från varandra

Question 5

På vilka två olika sätt kan flödescytometri användas för celler/partiklar?

Answer 5

För att analysera (vanligast) och sortera celler och partiklar

Question 6

Vad står FACS för?

Answer 6

Fluorescence Activated Cell Sorting

Question 7

Hur fungerar en fluorokrom?

Answer 7

Energi tillförs till ett ämne tex genom laserstrålar vilket får ämnets elektroner att exciteras till en högre energinivå. När elektronen går tillbaka till sin “ground state” emitteras energin som fluorescens. Det emitterade ljuset har annan våglängd än det som användes för excitation.

Question 8

Vilka två sorters cellmarkörer finns?

Answer 8

Ytmarkörer och intracellulära markörer

Question 9

Ge några exempel på ytmarkörer

Answer 9

• Lineage markers: CD3, CD4, CD8
• Aktiveringsmarkörer: CD69, CD154
• Homingreceptorer: CD62L (L-selektin), Alfa-4-beta-7

Question 10

Ge några exempel på intracellulära markörer

Answer 10

• Lineage markers: FOXP3 (Treg), T-bet (Th1), ROR-gamma-t (Th17)
• Celldelningsmarkörer: Ki57, BrdU, CFSE
• Funktionella markörer: Cytokiner och cytotoxiska effektormolekyler

Question 11

Vad är syftet med att analysera olika kombinationer av cellmarkörer samtidigt? Vad krävs för att det ska funka?

Answer 11

Syftet: gör det möjligt att analysera olika celltyper och deras funktion samtidigt

För att det ska funka krävs att man använder flera olika antikroppar märkta med olika fluorokromer samtidigt

Question 12

Beskriv arbetsflödet för flödescytometrin

Answer 12

1: Förberedelse av provet (helblod eller PBMCs)
2: Färgning samt tillsats av specifika fluorokrommärkta antikroppar. För intracellulär färgning måste cellmembranet permeabiliseras med detergent.
3: Eventuell lysering av röda blodkroppar (endast för helblodsprover)
4: Injektion i flödescytometern, analys av cellerna mha laser och detektorer
5: Dataanalys

Question 13

Hur många färger kan de flödescytometrar analysera som används kliniskt på SU?

Answer 13

8-10 olika fluorokromer/färger

Question 14

Vilka tre delar består flödescytometern av?

Answer 14

1. Flödessystem - för provet genom maskinen i vätskedröm
2. Optik - exciterar fluorokromer (laser) och samlar in ljus (detektorer)
3. Elektronik - omvandlar ljus till digital information och siffror

Question 15

Beskriv metodprincipen för flödescytometrin

Answer 15

1. Celler med fluorokrominmärkta antikroppar (i detta exempel anti-CD8: blå och anti-CD4: röd) förs in i flödescellen
2. Cellerna passerar genom flödescellen och lasern en och en
3. Laserljuset fokuseras mha linser och prismor mot cellen och träffar en cell i taget. Det emitterade ljuset förs från cellen, styrs och filtreras mha linser, speglar och filter till detektorer och vidare till datasystemet

Question 16

Vad säger “forward scatter” om cellen? Påverkas det av fluorescensen?

Answer 16

Forward scatter reflekterar storleken hos cellen. Påverkas ej av fluorescensen

Question 17

Vad säger “side scatter” om cellen? Hur fungerar det?

Answer 17

Side scatter reflekterar granulariteten hos cellen. Mer granulära celler sprider ljuset på ett visst sätt, det är ej fluorescens

Question 18

Vad reflekterar fluorescensintensiteten?

Answer 18

Hur många fluorokrommärkta antikroppar som bundit till cellen

Question 19

Hur går “gating” till vid dataanalysen av dot plots?

Answer 19

Man “sätter staket” runt olika “cellpopulationer” i diagrammen

Question 20

Vilka typer av dot plots finns? Hur många parametrar analyserar de?

Answer 20

Vanlig dot plot, pseudo colour plot och contour plot

2 parametrar???

Question 21

Vilka två kategorier av diagram finns? Hur många parametrar analyserar de? Vad visar de?

Answer 21

Histogram - analyserar en parameter. Är som ett stapeldiagram över antal celler med viss signalstyrka.

Dot plot - analyserar två parametrar i ett koordinatsystem. En prick = en cell

Question 22

Vilka är de huvudsakliga stegen i flödescytometrisk dataanalys?

Answer 22

1. Analys av forward och side scatter
2. Identifiera den huvudpopulation av celler du vill analysera (tex lymfocyter)
3. Sätt en gate runt celltypen
4. Fortsätt att analysera endast den utvalda cellpopulationen med avseende på bindning av fluorokrommärkta antikroppar

Question 23

Vid flödescytometrisk analys får man vanligtvis fram frekvensen av celler av en viss undertyp i en cellpopulation - varför inte koncentrationen? Hur kan man komma runt detta?

Answer 23

Flödescytometrar är dåliga på att mäta vilken volym prov som analyserats, men de är mycket bättre på att räkna antal celler.

Om man tillsätter små plastkulor i en känd mängd till provet (tex 100/ml) så kan man sedan se hur många kulor som detekterats och därmed veta hur mycket av provet som analyserats (tex 50 kulor = 0,5ml). Sedan relateras detta till antalet detekterade celler (100 000 celler i 0,5ml –> 200 000 celler/ml)

Question 24

Vad är principen för fagocytostest?

Answer 24

Man testar neutrofiler och monocyters fagocyteringsförmåga genom att utsätta dem för fluorescensinmärkta + opsoniserade E. coli. Sedan mäts mängden celler som fluorescerar, sk FITC+ celler, mha FACS

Question 25

Vad är principen för analys av intracellulär cytokinproduktion?

Answer 25

Cellernas intracellulära cytokinproduktion testas genom att cellens proteinuttransport blockeras. Sedan permeabiliseras membranet och cytokinspecifika, fluorokrommärkta antikroppar går in och binder till cytokinerna. Fluorescensen kan sedan mätas med FACS

Question 26

Hur används flödescytometri för att sortera celler?

Answer 26

Sorteringen sker efter den vanliga flödescytometrianalysen.
Cellerna placeras i vätskedroppar som får olika laddning beroende på vilka fluorokromer som detekterats på cellen, sedan sorteras dropparna mha elektromagneter

Question 27

Hur går kulbaserad flödescytometrisk multiplexanalys av cytokiner till, kortfattat?

Answer 27

Captureantikroppar specifika för cytokiner fästs till plastkulor som är färgade med en eller flera fluorescerande färger. En typ (färg) av kula coatas med antikroppar som känner igen en typ av cytokin. Till provet tillsätts också detektionsantikroppar som är märkta med fluorokromer.

Analysen baseras på flödescytometrisk detektion av fluorescenssignalerna från BÅDE kulorna OCH detektionsantikropparna.

Question 28

Varför behövs kulor för att analysera cytokinerna?

Answer 28

För att cytokinerna är för små för att flödescytometern ska känna igen dem som en partikel.