Molekylärbiologisk metodik inom virologi

Question 1

Vad brukar man säga ingår i traditionell virusdiagnostik?

Answer 1

• Virusodling
• Antikroppar
• Påvisning

Question 2

Vad står PCR för?

Answer 2

Polymerase chain reaction

Question 3

Herpes Simplexvirus (HSV) kan ge?

Answer 3

Blåsor genitalt, oralt, hud

Question 4

Varicella-zostervirus (VZV) kan ge?

Answer 4

CNS-encefalit, meningit

Question 5

Beskriv cytomegalovirus (CMV)

Answer 5

• Kan ge körtelfeber hos immunkompetenta
• Kan ge allvarlig sjukdom hos transplanterade och andra immunsupprimerade (Pneumonit, hepatit, feber, kolit, retinit)
• Kvantifiering av CMV-DNA i blodet

Question 6

Beskriv Epstein-Barrvirus (EBV)

Answer 6

• Körtelfeber hos immunkompetenta
• Feber, hepatit, PTLD hos immunsupprimerade
• Kvantifiering av EBV-DNA i blodet

Question 7

Beskriv hepatit C-virus (HCV)

Answer 7

• Kan orsaka kronisk inflammation, skrumplever och levercancer
• Genotypning före behandling
• HCV-RNA_analys för att bedöma behandlingseffekt

Question 8

Beskriv Hepatit B-virus (HBV)

Answer 8

• Kan orsaka kronisk inflammation, skrumplever och levercancer
• HBV-DNA-kvantifiering för att bedöma prognos eller behandlingssvar
• Genotypning inför behandling
• Sekvensering - molekylär epidemiologi

Question 9

Beskriv HIV

Answer 9

• Kvantifiering för att följa behandlingssvar
• PCR –> sekvensering för att påvisa resistensmutationer
  - RT-regionen, proteasregionen

Question 10

Vad finns det för virus som kan leda till Gastroenterit?

Answer 10

Rotavirus, calicivirus, adenovirus, astrovirus

Question 11

Vad finns det för bakterier som kan leda till Gastreoenterit?

Answer 11

Shigella, Salmonelle, V cholerae, Campylobacter, E coli (ETEC, EHEC, EIEC), Yersinia, Clostridium difficile

Question 12

Vad finns det för protozoer som kan leda till gasteroenterit

Answer 12

Cryptosporidium, Entamoeba, Giarda

Question 13

nämn två snabbtester för patientnära analyser för molekylärbiologisk metodik inom virologi.

Answer 13

• Filmarray

- GeneXpert

Question 14

Beskriv humant papillomvirus (HPV)

Answer 14

• 100 kända subtyper - 30 genitala subtyper

- 14 subtyper associerade till livmoderhalscancer

Question 15

Vad finns det för svagheter hos traditionell PCR?

Answer 15

• Specificiteten osäker
  - Fragmentets storlek
• Kontaminationsrisk
• Kvantifiering krånglig och inexakt

Question 16

Hur går snabbtestet Filmarrey till?

Answer 16

Extraktion, framrening av nukleinsyran, 2st PCR steg. Plastkort (mm tjocka, 10 cm långa) Frystorkade reagenser. Ett prov i taget

Question 17

Hur går snabbtestet GeneXpert till?

Answer 17

1h realtids PCR, fyrkantig kasett med reagenser. 1-16 prov

Har använts mycket under SARS

Question 18

Vad finns det för fördelar med realtids-PCR?

Answer 18

• Hög specificitet
• Hög sensitivitet
• Snabb
• Minskad kontaminationsrisk
• Möjlighet att kvantifiera och typa
• Utveckling/optimering av PCR

Question 19

Hur fungerar Taqman-probe (hydrolydprobe)

Answer 19

• Fluorescensen låg om probe är intakt
• Binder till amplifierat fragment
• Bryts ner av polymeraset
  - -> Fluorescens

Question 20

Vid kvantifiering ska Ct värdet för varje prov relateras till….?

Answer 20

Standardkurva (spädning av känd koncentration)
- Kvantifiering i kopior/mL

Ct-värdet för co.amplifierat (humant) DNA/RNA
- relativ kvantifiering (skillnad i Ct-värde)

Question 21

Vad händer om en probe inte passar perfekt?

Answer 21

bindningen och fluorescensen blir svag

Question 22

Vad händer om en primer inte passar i 3´-ändan

Answer 22

appliceringen blir dålig

Question 23

Hur går den digitala PCRen till?

Answer 23

• Provet späds och fördelas på många PCR-reaktioner (t.ex. 20,000)
• 20,000 taqman-reaktioner à 1nL
• Varje reaktion avläses + eller -
• Kan göras i emulsion eller chip
• Baserat på relationen positiva/negativa reaktioner kan koncentrationen beräknas

Question 24

Vad finns det för användningsområden inom mikrobiologin för digital PCR?

Answer 24

• Absolut kvantifiering med högre precision
• Påvisa fraktioner med resistensmutationer
• Kvantifiera standarder
• Forskning

Question 25

Vad är syftet med sekvensering?

Answer 25

• Identifiering av virus och bakterier
• Genotypning
• Molekylär epidemiologi
• Resistensmutationer

Question 26

Kedjestoppssekvensering (Sanger)

Answer 26

• Oftast PCR först
• Ibland kloning
• “cycle sequencing” för att skapa alla längder
• Avläsning med elektrofores

Question 27

Hur ser arbetsflödet ut vid sekvensering?

Answer 27

• PCR, kolla band
• (Rening)
• Cyklisk sekvensering, kolla band
• (rening)
• Läsning i instrument
• Visuellt kolla av sekvensen, redigering, tolkning

Question 28

Vad finns det för begränsningar vid sekvensering?

Answer 28

• Svårt om koncentrationerna är låga eller om virus är mycket variabelt
• Annat DNA kan ha amplifierats, vilket ger ett brus med extrakurvor i kromatogrammet
• Tidskrävande om man vill ha hela virus, nästan omöjligt att få humant genom

Question 29

Vad påverkas selektion av? (hur virusen utvecklas?)

Answer 29

Genetisk barriär
- Krävs en eller flera mutationer?

Fitness
- Hur väl kan muterat virus replikeras?

Kompensatoriska mutationer
- Kan fitness förbättras genom andra mutationer?

Question 30

Vad är Fylogeni?

Answer 30

Jämförelse av sekvenser för att försöka förstå hur de utvecklats

Question 31

MPS/NGS

Answer 31

• Varje körning ger massor av “reads”, alltså avlästa sekvenser som är 200-400 nt
• Dessa reads jämförs med varandra och ofta med en referenssekvens för att fogas samman
• Varje position finns ofta i många reads. Detta “djup” påverkar hur säkert positionen kan bedömas.