Non-invasive prenatal testning (NIPT) Flashcards
Hur går NIPT till och hur stor risk för missfall är det vid användning av denna metoden?
NIPT/NIPS är som sagt ett icke-invasivt test. Ett blodprov från modern kan påvisa kromosomförändringar hos fostret. Det är ett screeningtest men kräver ett efterföljande bekräftande test om man stöter på ett fynd. Det är vid denna undersökning mindre än 0,01% chans för missfall men man kan få läckage och oro inför provtagningen. Analysen sker på cellfritt DNA som finns i mammans blodplasma.
Vilka typer av mutationer kna också ses från blodprovet som tas vid NIPT?
Från mammans blodprov kan man även titta diagnostiskt på fostret men det gäller då specifika mutationer som finns endast hos fostret eller som kommer från pappan - mamman får alltså inte ha samma mutationer om man ska detektera dem hos fostret. Då man tar blodproverna och analyserar dem kommer man potentiellt få söka i pappans blodplasma då den allra största delen av det cellfria DNA:t nämligen kommer från mamman.
Varifrån kommer det cellfria DNA som tas från mammans blodplasma vid NIPT?
Vid vilka andra tillfällen kan cellfritt DNA också hittas i blodet?
Hur stora är dessa DNA-fragment?
Cellfritt DNA finns i blodplasman och kommer från apoptotiska celler.
Man har också cellfritt DNA om man bär på en cancertumör vilket används inom radiologin. Det kan komma från transplanterade organ, foster (placenta) men merparten kommer från normala celler. Även vid inflammation har man mer cellfritt DNA, som efter en joggingtur.
Detta DNA kommer återfinnas i korta fragment på mindre än 160 nt. Om man separerar plasma-komponenter kan man utvinna detta DNA.
Varifrån kommer cellfritt DNA från fostret och hur stor andel av DNA:t i blodet är det?
Utom cellfritt DNA från mamman själv finns även cellfritt DNA från fostret (cff-DNA). Man säger att det är fetalt cellfritt DNA men det kommer egentligen från apoptotiska celler i placentan. Ett sådant prov är egentligen mer att likställa med chorionvillibiopsi (CVS).
Mindre än 1% av totalt DNA kommer från fostret/placenta. 5-30% av cellfritt DNA kommer från fostret/placentan där resten är mammans cellfria DNA (cfDNA). Koncentrationen kommer öka under graviditeten. Fetalfraktion är den mängd som kommer från fostret/placenta. Fetalfraktionen som sagt att öka under graviditen tills man ungefär vid vecka 10 kan utföra NIPT och få ett svar. Det som är bra med cfDNA är att det är specifikt enbart för den pågående graviditeten - 24 timmar efter att förlossningen har skett kan man inte längre detektera något cfDNA från fostret.
Hur används NGS vid NIPT och vilka 2 approach finns det?
NGS möjliggör avläsning av många DNA-fragment. Man får en känslighet i sin analys i jämförelse med Sangersekvensering.
Vad gäller NIPT vill man titta specifikt på t.ex. trisomi 13, 18 och 21 och vill då testa deras prevalens. Man finner då DNA-fragment blandade med fragment från andra kromosomer. Det finns två approacher efter det här:
- Helgenomsekvensering
- Riktad analys
Vilka för- och nackdelar finns det med helgenomsekvensering NGS vid NIPT?
Helgenomsekvensering leder till att man får data från alla kromosomer, inte bara 13, 18 och 21. Man kan inte heller få ett stort djup i sekvensering och får färre antal läsningar. Det kräver ofta större instrument och en dyrare analys.
Vilka för- och nackdelar finns det med riktad NGS vid NIPT?
Riktad NGS är en sekvensering av utvalda kromosomer. Det finns olika varianter men man kan med PCR amplifiera upp specifika amplikon från kromosom 13, 18 och 21 och sedan läsa av dem. Det krävs då inte lika många läsningar i NGS-instrumentet vilket medför en både snabbare och billigare analys.
Hur ser ett flödesschema ut för MPSS (NGS) för NIPT?
- Den fetala fraktionen av DNA-fragment finns i moderns plasma och kommer symboliseras av de röda fragment.
- Detta sekvenseras och man använder bioinformatik. Det sker då en alignment av varje fragment med rätt kromosom.
- Det kommer sedan göras en utvärdering av andelen unika avläsningar från exempelvis chr21 som jämförs med ett prov från en euploid kvinna.
- Man får då en z-score som representerar ett medelvärde. Det är här fetalfraktionen kommer in. En för låg fetalfraktion kan inte ge ett säkert svar. Får man en positiv signal, ett fynd på denna analys med låg fetalfraktion, krävs det att man gör ett bekräftande test med ett invasivt test för att bekräfta att det verkligen finns en trisomi.
Anledningen att detta gäller är för att det blir en procentuell förändring i reads från chr21 vid trisomi jämfört med disomi så en större fetalfraktion innebär en kvantitativ skillnad som är större och därmed blir denna analys mer säkerställd.
Hur ser ett flödesschema ut vid NIPT med rolling Circle amplification?
Ytterligare en metod som inte är NGS-baserad och som är relativt ny och utvecklad i Sverige är att (istället för NGS) använda “rolling circle amplification”. På samma sätt som tidigare tar man blodplasma från mamman och extraherar cellfria DNA-fragment. Dessa fragment får binda till tusentals prober som är speciella för kromosom 13, 18, 21. Proberna är väldigt specifika och när de binder får man en cirkulär molekyl där man sedan kan fästa primers för “rolling circle amplification”. Det är inte PCR men man får ändå en amplifiering eftersom man läser av cirkeln om och om igen just på grund av den cirkulära formen. Det blir så mycket DNA att en boll bildas. Denna boll kan taggas, samlas in med nanofilter och läsas av. Med imaging kan man räkna ut risken för trisomi. Man jämför hur mycket “bollar” fostret har i jämförelse med hur många bollar man brukar få hos en euploid person.
Hur ser flödesschema ut vid riktad analys?
Det finns som sagt även riktad NGS-teknik. Där tar man plasman och fetalt cfDNA och jämför det med mammans DNA från leukocyter. Det ger kanske en stabilare analys. Det man får är alltså en komparativ analys mellan maternal och fetal genotyp.
En annan riktad metod är att man istället för att amplifiera områden har prober som binder in till specifika fragment på chr13, chr18 och chr21. När proberna binder in kan man anrika dessa fragment och sedan sekvensera dem med NGS eller göra en arrayanalys på dessa.
Vad är för- och nackdelarna med NIPT och KUB?
NIPT är en mer precis analys. Med KUB finns ändå en rätt hög nivå falska positiv. Det har lett till att många har gjort invasiv provtagning. NIPT har också en hög detektionsnivå. NIPT har använts mer som en sekundär screeningmetod.
Om till exempel KUB inte visar någon risk kommer det innebära rutinmässig mödravård medan om KUB visar hög risk kan ccfDNA testning utföras.
Vad säger SBU-rapporten om hur man ska gå till väga gällande att utföra invasiv prenatal testning?
SBU kom för ett antal år sedan med ett förslag för hur man ska gå tillväga i Sverige. De rekommenderar att man först utför KUB. Har man en risk som är större än 1/50 kan man tillåta kvinnan utföra ett invasivt prov. Om risken är mellan 1:51-1:1000 kan man utföra NIPT och beroende på om det är ett positiv fynd gå vidare med ett invasivt prov. Om risken är mindre än 1:1000 gör man ingenting.
KUB testet är alltså inte lika specifikt som NIPT, där man vid KUB kan göra missar av testresultatet. De flesta som gör KUB är redan >35 år och det finns skillnader i hur det används i landet.
