4. Hur studerar man en patients DNA? Flashcards
Vilket år introducerades genetiska laboratorieanalyser och vad används dessa till?
Genetiska laboratorieanalyser introducerades kring år 1960 och används vid allt fler kliniska områden.
Framsteg och utveckling av genteknologiska metoder har ökat kunskapen om genetiska orsaker till sjukdom.
Genetiska analyser kommer användas till att identifiera mutationer, förändringar i vårt genom.
Vad innebär monogena och polygena sjukdomar?
Sjukdomar kan vara monogena vilket innebär att det är en gen som ger upphov till sjukdomen eller så kan de vara polygena, vilket innebär att det är flera gener som ger upphov till sjukdomen.
Vilka 4 saker görs om en mutation kan påvisas hos en patient?
- Man får diagnosmisstanken bekräftad och kan ge en genetisk diagnos
- Man kan få viss indikation på förväntat förlopp av sjukdomen
- Man kan erbjuda anlagstestning av andra familjemedlemmar
- Fosterdiagnostik kan erbjudas vid en graviditet.
Hur många kromosomer och proteinkodande gener består det humana genomet av?
Hur stor andel av genomet är proteinkodande sekvenser?
Genomet lagras som DNA-sekvenser i 23 kromosompar i cellkärnan och i en liten DNA-molekyl i mitokondrien.
Det humana genomet består av cirka 22 000 proteinkodande gener.
Proteinkodande sekvenser kommer utgöra bara runt 1.5% av vårt genom.
Vad består resterande genomet av som inte är proteinkodande gener?
Resten är förknippat med icke-kodande-RNA-molekyler, regulatoriska DNA-sekvenser, introner och sekvenser som vi ännu inte känner till dess funktion.
Hur många SNP (single nucleotide polymorphism) uppskattas vårt genom ha?
I vårt genom har vi uppskattningsvis en SNP (single nucleotide polymorphism) var 1000 baspar.
Trots SNPs så är vi ändå genetiskt lika.
Hur stor andel av patogena varianter som identifieras vid monogena sjukdomar hittas i proteinkodande genomet?
85% av patogena varianter som identifieras vid monogena sjukdomar kommer hittas i de kodande delarna av genomet, d.v.s. exonerna eller i splice-säten.
Detta medför att om man ska studera DNA så kan man undersöka de 1,5% som är proteinkodande sekvenser.
Ge exempel på 7 olika genetiska analyser.
Det finns olika sorters genetiska analyser som man kan använda beroende på vad man vill analysera.
- Karyotypering
- aCGH
- SKY
- NGS
- MLPA
- FISH
- Sanger-sekvensering
Vad innebär heögenoma respektive genspecifika analyser?
I stora drag kan man välja att använda helgenoma analyser.
Detta innebär att man undersöker allt DNA som finns i en cell med en metod.
Man kan också utföra genspecifika analyser.
Där använder man en metod där man undersöker en viss gen, oftast när man har en specifik frågeställning.
Varför kan det vara bättre att göra genspecifika analsyer istället för helgenom?
Båda metoder kan ge samma svar, t.ex. kan en helgenomanalys ge upphov till ett genspecifikt svar, men att studera hela genomet är mer omständigt.
Det finns även en etisk aspekt - sekvenserar man hela genomet så kan man hitta gener som patienten inte frågade efter, t.ex. att man hittar andra gener som kan ge upphov till sjukdom bortsett från de sjukdomar som fanns i frågeställningen.
Metoderna har olika bra upplösning och är mer lämpliga för olika sjukdomstillstånd - vilken metod är bäst vid undersökning av enbasmutationer, trisomi 21 respektive cystisk fibros?
Olika metoders upplösning är hur bra de är på att upptäcka olika sjukdomstillstånd.
Om man enbart ska undersöka en enbasmutation kanske man kan välja en PCR-baserad metod.
Om man istället ska undersöka trisomi 21 är det mer lämpligt att utföra cytogenetik och kolla på hela kromosomer.
Vid cystisk fibros så undersöker man mutationer av enstaka nukleotider i CFTR-genen och då kör man en PCR (Polymerase Chain Reaction).
Kontentan är att man använder olika metoder beroende på vilken sjukdom man letar efter eller undersöker.
Vilka 3 helgenomsanalyser används?
Karyotypering
Gendos-arrayer: CGH eller SNP
NGS
Hur utförs cytogenetik analys och varifrån tas cellmaterialet?
Vilka 2 tekniker används för diagnostisering och vilka sjukdomar kan det röra sig om?
Cytogenetik utförs genom att man tar prover för analys av större kromosomavvikelser och även för en analys av numeriska avvikelser i kromosomerna.
Cellmaterial från olika typer av vävnader som fostervatten, moderkaka, blod, benmärg och hud kommer odlas upp och sprids på objektglas för vidare analys i mikroskop.
För cytogenetik använder man tekniker som G-bandning och karyotypering av kromosomer från detta cellmaterial för att kunna diagnostisera misstanke av kromosomavvikelser vid fosterdiagnostik, leukemiutredningar samt syndromutredningar
När används karyotypering och hur går det till?
Karyotypering används för att man ska få en bild över kromosomernas antal och dess utseende för att hitta genetiska avvikelser som kan förklaras av ett visst sjukdomstillstånd, exempelvis Downs syndrom (Trisomi 21).
Vid karyotypering arresteras kromosomerna i mitosens metafas. Det är en helgenomanalys.
Hur används karyotypering för diagnos av kronisk myeloisk?
Ett exempel där karyotypering är relevant för diagnostik är vid kronisk myeloisk leukemi (KML) där en fusionsgen skapas mellan kromosom 22 och kromosom 9.
Den fusionsgen som skapas kallas BCR-ABL och kommer ge ett fusionstranskript med andra egenskaper som t.ex. att genen hamnar under starkare promotor som genererar mer transkript.
Vilka två former av Gendos-arrayer finns det?
Gendos-arrayer finns i form av CGH-arrayer (Comparative Genomic Hybridization) och SNP-arrayer (Single Nucletoide Polymorfism array).
Vad kan ses vid analys med CGH-arrayer?
Antalet kopior av en gen/kromosom:
trisomi = 3 kopior
disomy = 2 kopior
monosomi = 1 kopia
Ligger en deletion i någon av de 98,5% icke-kodande regionerna behöver det dock inte innebära sjukdom.
Hur går FISH-analys till och vilka 3 avvikelser kan detekteras med denna metod?
FISH (Fluorescence In Situ Hybridization) innebär att kromosomer har lagts ut på ett objektglas.
Man märker med en prob som kan finnas i olika färger (t.ex. grön eller röd).
Proben hybridiserar med denaturerade kromosomer och har en fluorescerande tagg.
Med denna metod kan man detektera en genamplifiering, en gendeletion eller en gentranslokation.
Hur kan FISH användas för utredning av trisomi 21?
Man lägger in sina prober, denaturerar DNA:t och då kommer proben att binda till delen på DNA:t som är komplementär till den.
I detta fall kommer proben binda till en region på kromosom 21.
Man kan då se kromosomer: två gröna (kontroll) eller tre röda (kromosom 21)
Dessa färger syns på olika kromosomer.
Visas tre stycken prober på kromosom 21 beror ju detta på att en patient som har trisomi 21 har tre stycken kromosom 21.
Hur kan FISH-analys användas för utredning av bröstcancer och vilken gen är det som är involverad?
Vid cancer lär inte alla celler man undersöker ha kromosomavvikelser och man kan då på specifika celler undersöka om gener kommer saknas.
Man kan alltså även använda FISH vid undersökning av bröstcancer.
- Två gröna (centromer prober)
- Röd (amplifiering av HER2)
Mellan 10-15% av alla som har bröstcancer har en HER2-positiv tumör vilket innebär att HER2-genen är amplifierad.
HER2-positiv bröstcancer är en mer aggressiv form av bröstcancer med ökad risk för spridning och återfall.
Tumörer med en HER2 amplifiering kan behandlas med en målriktad terapi som kommer minska risk för spridning och återfall.
Hur går PCR till och vilka olika temperaturer krävs för respektive steg?
Templat, primers, dNTP, buffert, DNA-polymeras och Mg2+ cofaktor stoppas in i ett provrör, DNA:t denatureras vid 95°, primers binder in vid en lägre temperatur som är ungefär 50-60°, temperaturen ökar igen till 72° och DNA-polymeras kopierar vid denna temperatur.
Därefter återupprepas processen i många olika cyklar och på så sätt får man en amplifiering av genen.
Denaturering → Hybridisering → Förlängning
PCR kommer att amplifiera ett specifikt DNA-segment exponentiellt (2n) så länge som de olika komponenterna är tillräckliga i mängd för att uppnå detta.
Duchennes muskeldystrofi drabbar främst pojkar/män och sitter på X-kromosomen (X-bunden recessiv sjukdom).
I de flesta fallen där man får Duchennes har man deletioner av stora delar av Duchennegenen (DMD-genen).
Vilken typ av PCR används för att analysera dessa gener?
En multiplex PCR går ut på att analysera dystrofigenen på kromosom X som har 79 exoner.
Det är 9 exoner av dessa 79 exoner som oftast är de som blir deleterade vid sjuksomen.
Man utförde därför en PCR-analys av dessa 9 exon i 20 stycken sjuka pojkar och kunde då se att vissa exoner saknas.
Hur går Sangersekvensering till?
Man börjar med en vanlig PCR-reaktion men lägger till ddNTP och gör i princip samma reaktion igen med PCR-produkten som templat.
När ddNTP binder in kommer elongering att upphöra.
Då ddNTP är färre till antalet än dNTP kommer det vara en högre sannolikhet för en dNTP-nukleotid att inkorporeras men då ddNTP inkorporeras kommer detta som sagt terminera elongering då det saknas en OH-grupp på 3’-kolet
För att få fram själva sekvensen separerar man de olika genfragmenten efter storlek.
När man stoppar in alla fragment kommer de att läsas av i storleksordning i maskinen och omvandlas till en sekvens.
Desto större fragment, desto mer av sekvensen lyckades man bygga upp innan en ddNTP terminerade elongeringen.
Avläsningen av varje fragment sker med en fluoroscensläsare.
Vad sker vid frame-shift-mutationer och hur kan dessa ses vid analys?
Vid frame-shift-mutationer kan man se dubbeltoppar i grafen för ljus/nukleotid i sekvensen.
Det beror på att man får olika toppar vid olika ljus/nukleotider - det tyder på kontrollens sekvens och patientens sekvens inte stämmer överens.
Det beror på att patienten har en insertion eller deletion som gjort att de två sekvenserna in längre “synkar upp”.
Varför kan det vara bra att utreda systrar till pojkar som drabbats av Duchennes muskeldystrofi?
På sin ena X-kromosom har Lisa (b) samma deletion på hennes DMD-gen som sin bror men på sin andra kromosom är hon frisk. Det kan vara bra att veta eftersom heterozygoter också kan drabbas av muskelsvagheter och hjärtproblem i framtiden.
Samtidigt är det också bra att veta om hon ämnar att skaffa barn eftersom hon har en 50% chans att ge X-kromosomen med deletionen till sitt barn vilket är särskilt problematiskt om hon får en pojke.
Pair-end sequencing har använts här: vad kan man har skett i a, b, c och d?
A. Sekvensen från vardera ända av ett 2 kb fragment kommer ligga komplementärt och justerat efter referensgenomet
B. Sekvenser som är 2 kb ifrån varandra i patientens DNA är 3 kb från varandra i referensgenomet. Patienten har haft en deletion på 1 kb någonstans i mellan paired ends
C. Sekvenser som är 2 kb ifrån varandra i patientens DNA är 1 kb från varandra i referensgenomet. Patienter har haft en insertion på 1 kb någonstans i regionen mellan paired ends.
D. Sekvenser som är orienterade i en viss riktning i patientens DNA är riktade åt motsatt håll i referensgenomet. Patienten har haft en inversion med en breakpoint mellan paired ends.
