4. Hur studerar man en patients DNA?

Question 1

Vilket år introducerades genetiska laboratorieanalyser och vad används dessa till?

Answer 1

Genetiska laboratorieanalyser introducerades kring år 1960 och används vid allt fler kliniska områden.

Framsteg och utveckling av genteknologiska metoder har ökat kunskapen om genetiska orsaker till sjukdom.

Genetiska analyser kommer användas till att identifiera mutationer, förändringar i vårt genom.

Question 2

Vad innebär monogena och polygena sjukdomar?

Answer 2

Sjukdomar kan vara monogena vilket innebär att det är en gen som ger upphov till sjukdomen eller så kan de vara polygena, vilket innebär att det är flera gener som ger upphov till sjukdomen.

Question 3

Vilka 4 saker görs om en mutation kan påvisas hos en patient?

Answer 3

1. Man får diagnosmisstanken bekräftad och kan ge en genetisk diagnos
2. Man kan få viss indikation på förväntat förlopp av sjukdomen
3. Man kan erbjuda anlagstestning av andra familjemedlemmar
4. Fosterdiagnostik kan erbjudas vid en graviditet.

Question 4

Hur många kromosomer och proteinkodande gener består det humana genomet av?

Hur stor andel av genomet är proteinkodande sekvenser?

Answer 4

Genomet lagras som DNA-sekvenser i 23 kromosompar i cellkärnan och i en liten DNA-molekyl i mitokondrien.

Det humana genomet består av cirka 22 000 proteinkodande gener.

Proteinkodande sekvenser kommer utgöra bara runt 1.5% av vårt genom.

Question 5

Vad består resterande genomet av som inte är proteinkodande gener?

Answer 5

Resten är förknippat med icke-kodande-RNA-molekyler, regulatoriska DNA-sekvenser, introner och sekvenser som vi ännu inte känner till dess funktion.

Question 6

Hur många SNP (single nucleotide polymorphism) uppskattas vårt genom ha?

Answer 6

I vårt genom har vi uppskattningsvis en SNP (single nucleotide polymorphism) var 1000 baspar.

Trots SNPs så är vi ändå genetiskt lika.

Question 7

Hur stor andel av patogena varianter som identifieras vid monogena sjukdomar hittas i proteinkodande genomet?

Answer 7

85% av patogena varianter som identifieras vid monogena sjukdomar kommer hittas i de kodande delarna av genomet, d.v.s. exonerna eller i splice-säten.

Detta medför att om man ska studera DNA så kan man undersöka de 1,5% som är proteinkodande sekvenser.

Question 8

Ge exempel på 7 olika genetiska analyser.

Answer 8

Det finns olika sorters genetiska analyser som man kan använda beroende på vad man vill analysera.

• Karyotypering
• aCGH
• SKY
• NGS
• MLPA
• FISH
• Sanger-sekvensering

Question 9

Vad innebär heögenoma respektive genspecifika analyser?

Answer 9

I stora drag kan man välja att använda helgenoma analyser.

Detta innebär att man undersöker allt DNA som finns i en cell med en metod.

Man kan också utföra genspecifika analyser.

Där använder man en metod där man undersöker en viss gen, oftast när man har en specifik frågeställning.

Question 10

Varför kan det vara bättre att göra genspecifika analsyer istället för helgenom?

Answer 10

Båda metoder kan ge samma svar, t.ex. kan en helgenomanalys ge upphov till ett genspecifikt svar, men att studera hela genomet är mer omständigt.

Det finns även en etisk aspekt - sekvenserar man hela genomet så kan man hitta gener som patienten inte frågade efter, t.ex. att man hittar andra gener som kan ge upphov till sjukdom bortsett från de sjukdomar som fanns i frågeställningen.

Question 11

Metoderna har olika bra upplösning och är mer lämpliga för olika sjukdomstillstånd - vilken metod är bäst vid undersökning av enbasmutationer, trisomi 21 respektive cystisk fibros?

Answer 11

Olika metoders upplösning är hur bra de är på att upptäcka olika sjukdomstillstånd.

Om man enbart ska undersöka en enbasmutation kanske man kan välja en PCR-baserad metod.

Om man istället ska undersöka trisomi 21 är det mer lämpligt att utföra cytogenetik och kolla på hela kromosomer.

Vid cystisk fibros så undersöker man mutationer av enstaka nukleotider i CFTR-genen och då kör man en PCR (Polymerase Chain Reaction).

Kontentan är att man använder olika metoder beroende på vilken sjukdom man letar efter eller undersöker.

Question 12

Vilka 3 helgenomsanalyser används?

Answer 12

Karyotypering

Gendos-arrayer: CGH eller SNP

NGS

Question 13

Hur utförs cytogenetik analys och varifrån tas cellmaterialet?

Vilka 2 tekniker används för diagnostisering och vilka sjukdomar kan det röra sig om?

Answer 13

Cytogenetik utförs genom att man tar prover för analys av större kromosomavvikelser och även för en analys av numeriska avvikelser i kromosomerna.

Cellmaterial från olika typer av vävnader som fostervatten, moderkaka, blod, benmärg och hud kommer odlas upp och sprids på objektglas för vidare analys i mikroskop.

För cytogenetik använder man tekniker som G-bandning och karyotypering av kromosomer från detta cellmaterial för att kunna diagnostisera misstanke av kromosomavvikelser vid fosterdiagnostik, leukemiutredningar samt syndromutredningar

Question 14

När används karyotypering och hur går det till?

Answer 14

Karyotypering används för att man ska få en bild över kromosomernas antal och dess utseende för att hitta genetiska avvikelser som kan förklaras av ett visst sjukdomstillstånd, exempelvis Downs syndrom (Trisomi 21).

Vid karyotypering arresteras kromosomerna i mitosens metafas. Det är en helgenomanalys.

Question 15

Hur används karyotypering för diagnos av kronisk myeloisk?

Answer 15

Ett exempel där karyotypering är relevant för diagnostik är vid kronisk myeloisk leukemi (KML) där en fusionsgen skapas mellan kromosom 22 och kromosom 9.

Den fusionsgen som skapas kallas BCR-ABL och kommer ge ett fusionstranskript med andra egenskaper som t.ex. att genen hamnar under starkare promotor som genererar mer transkript.

Question 16

Vilka två former av Gendos-arrayer finns det?

Answer 16

Gendos-arrayer finns i form av CGH-arrayer (Comparative Genomic Hybridization) och SNP-arrayer (Single Nucletoide Polymorfism array).

Question 17

Vad kan ses vid analys med CGH-arrayer?

Answer 17

Antalet kopior av en gen/kromosom:

trisomi = 3 kopior

disomy = 2 kopior

monosomi = 1 kopia

Ligger en deletion i någon av de 98,5% icke-kodande regionerna behöver det dock inte innebära sjukdom.

Question 18

Vilka 5 genspecifika analyser används?

Answer 18

1. FISH (fluorescence In situ hybridization)
2. PCR (polymerase chain reaction) - t.ex. fragmentanalys
3. MLPA (Multiplex Ligation Dependent Probe Amplification)
4. Sanger-sekvensering (+PCR)
5. NGS (Next Generation Sequencing - genpanel/analysera kandidatgener

Question 19

Hur går FISH-analys till och vilka 3 avvikelser kan detekteras med denna metod?

Answer 19

FISH (Fluorescence In Situ Hybridization) innebär att kromosomer har lagts ut på ett objektglas.

Man märker med en prob som kan finnas i olika färger (t.ex. grön eller röd).

Proben hybridiserar med denaturerade kromosomer och har en fluorescerande tagg.

Med denna metod kan man detektera en genamplifiering, en gendeletion eller en gentranslokation.

Question 20

Hur kan FISH användas för utredning av trisomi 21?

Answer 20

Man lägger in sina prober, denaturerar DNA:t och då kommer proben att binda till delen på DNA:t som är komplementär till den.

I detta fall kommer proben binda till en region på kromosom 21.

Man kan då se kromosomer: två gröna (kontroll) eller tre röda (kromosom 21)

Dessa färger syns på olika kromosomer.

Visas tre stycken prober på kromosom 21 beror ju detta på att en patient som har trisomi 21 har tre stycken kromosom 21.

Question 21

Hur kan FISH-analys undersöka delegationer?

Answer 21

Man kan även upptäcka deletioner med hjälp av FISH: två gröna (kontroll) och två röda på olika kromosomer innebär ingen deletion.

Ser man två gröna och en röd är en röd är deleterad.

Question 22

Hur kan FISH-analys användas för utredning av bröstcancer och vilken gen är det som är involverad?

Answer 22

Vid cancer lär inte alla celler man undersöker ha kromosomavvikelser och man kan då på specifika celler undersöka om gener kommer saknas.

Man kan alltså även använda FISH vid undersökning av bröstcancer.

• Två gröna (centromer prober)
• Röd (amplifiering av HER2)

Mellan 10-15% av alla som har bröstcancer har en HER2-positiv tumör vilket innebär att HER2-genen är amplifierad.

HER2-positiv bröstcancer är en mer aggressiv form av bröstcancer med ökad risk för spridning och återfall.

Tumörer med en HER2 amplifiering kan behandlas med en målriktad terapi som kommer minska risk för spridning och återfall.

Question 23

Vad används PCR och vad är principen bakom det?

Answer 23

Processen uppfanns 1993.

PCR används för att framställa stora mängder av en viss DNA-sekvens.

Detta kommer ske genom en reaktion i flera steg som utförs med hjälp av primers och DNA-polymeras.

Analys av PCR-produkter sker därefter med hjälp av t.ex. gelelektrofores.

Question 24

Vilka 6 saker behövs för PCR?

Answer 24

1. Templat
2. Primers - gör att man får en genspecificitet - de definierar vilket PCR-fragment man vill ha. Man använder forward och reverse primer dit polymeraset binder och initierar kopiering av DNA.
3. dNTP - är substrat för DNA-polymerasets påbyggnad.
4. Buffert
5. DNA-polymeras - är enzymet som kommer kopiera DNA
6. Mg2+ som co-faktor

Question 25

Hur påverkas PCR av olika mängder cofaktorer (Mg2+) som tillsätts?

Answer 25

Tillsätter man olika mängder kofaktorer kan man påverka hur stringent metoden är. Desto mer magnesium som används, desto mer ospecifik blir metoden eftersom polymeraset kan börja binda andra segment på DNA:t. Används för att få en bra miljö för DNA-polymeras och DNA:t vad gäller pH och salthalt

Question 26

Hur går PCR till och vilka olika temperaturer krävs för respektive steg?

Answer 26

Templat, primers, dNTP, buffert, DNA-polymeras och Mg2+ cofaktor stoppas in i ett provrör, DNA:t denatureras vid 95°, primers binder in vid en lägre temperatur som är ungefär 50-60°, temperaturen ökar igen till 72° och DNA-polymeras kopierar vid denna temperatur. Därefter återupprepas processen i många olika cyklar och på så sätt får man en amplifiering av genen. **Denaturering → Hybridisering → Förlängning** PCR kommer att amplifiera ett specifikt DNA-segment exponentiellt (2n) så länge som de olika komponenterna är tillräckliga i mängd för att uppnå detta.

Question 27

Duchennes muskeldystrofi drabbar främst pojkar/män och sitter på X-kromosomen (X-bunden recessiv sjukdom). I de flesta fallen där man får Duchennes har man deletioner av stora delar av Duchennegenen (DMD-genen). Vilken typ av PCR används för att analysera dessa gener?

Answer 27

En **multiplex PCR** går ut på att analysera dystrofigenen på kromosom X som har 79 exoner. Det är 9 exoner av dessa 79 exoner som oftast är de som blir deleterade vid sjuksomen. Man utförde därför en PCR-analys av dessa 9 exon i 20 stycken sjuka pojkar och kunde då se att vissa exoner saknas.

Question 28

Huntingtons sjukdom är en **autosomal dominant sjukdom** på exon 1 på kromosom 4 som beror på **CAG-repeats** i genen för **huntington**. Hur många CAG-repeats är inom normalspannet och hur många har man vid Huntingtons sjukdom?

Answer 28

Tillräckligt många CAG-repeats i en följd kommer ge upphov till sjukdomar. Normalspannet är mellan 5 och 35 kodon av CAG. Har man 36-39 CAG-kodon i exon 1 är man däremot *predisponerad* för Huntingtons sjukdom. Har man \>40 CAG-repeats i HD-genen så *kommer man få* Huntingtons sjukdom under livets gång.

Question 29

Hur skiljer sig CAG-repeats hos en frisk individ från en Huntington patient?

Answer 29

Frisk: 17 repeats på ena kromosomen och 22 repeats på andra kromosomen ⇒ frisk individ. Sjuk: 18 och 41 repeats på kromosomerna hos en annan individ ⇒ sjuk individ.

Question 30

Vilka komponenter behövs vid Sangerssekvensering och hur märks olika nukleotider ut?

Answer 30

För Sangersekvensering kommer det behövas komponenter lika de vid PCR men man tillsätter även **ddNTP (dideoxynukleotider)** som kommer innebära att DNA-kedjan inte kan elongeras bortom denna nukleotid. Dideoxynukleotiderna är ofta märkta med **fluoroforer** (molekyler som ger upphov till olika färger) och tillförs ofta på följande vis: ddATP - grönt ddCTG - blått ddGTG - svart ddTTP - rött Man kommer använda sig av templat i form av en PCR-produkt samt en forward primer eller en reverse primer, dNTP, DNA-polymeras, buffert, co-faktor (Mg2+) och ddNTP som är inmärkt.

Question 31

Hur går Sangersekvensering till?

Answer 31

Man börjar med en vanlig PCR-reaktion men lägger till ddNTP och gör i princip samma reaktion igen med PCR-produkten som templat. När ddNTP binder in kommer **elongering** att upphöra. Då ddNTP är färre till antalet än dNTP kommer det vara en högre sannolikhet för en dNTP-nukleotid att inkorporeras men då ddNTP inkorporeras kommer detta som sagt terminera elongering då det saknas en OH-grupp på 3’-kolet För att få fram själva sekvensen separerar man de olika genfragmenten efter storlek. När man stoppar in alla fragment kommer de att läsas av i storleksordning i maskinen och omvandlas till en sekvens. Desto större fragment, desto mer av sekvensen lyckades man bygga upp innan en ddNTP terminerade elongeringen. Avläsningen av varje fragment sker med en fluoroscensläsare.

Question 32

Vid användning av Sangersekvensering kliniskt krävs ett referensmaterial - vad ses vid en heterozygot respektive homozygot mutation?

Answer 32

För att kunna använda Sangersekvensering kliniskt kommer man att behöva ett referensmaterial. Vid en **heterozygot** mutation kommer t.ex. kontrollen ha ett T medan patienten har en dubbel topp A/T. Vid en **homozygot** mutation kommer kontrollen inte ha en motsvarighet vid denna nukleotid.

Question 33

Vad sker vid frame-shift-mutationer och hur kan dessa ses vid analys?

Answer 33

Vid frame-shift-mutationer kan man se dubbeltoppar i grafen för ljus/nukleotid i sekvensen. Det beror på att man får olika toppar vid olika ljus/nukleotider - det tyder på kontrollens sekvens och patientens sekvens inte stämmer överens. Det beror på att patienten har en insertion eller deletion som gjort att de två sekvenserna in längre “synkar upp”.

Question 34

Vad är MLPA-analys och vilket syfte har den?

Answer 34

***MLPA - Multiplex Ligation-Dependent Probe Amplification*** är en ligeringsbaserad metod som är en variant av multiplex PCR och tillåter *flera* regioner/mål att bli amplifierade med endast ett primerpar. Metoden är genspecifik.

Question 35

Hur gå MLPA-analys till och vilka komponenter är viktiga?

Answer 35

Om man har flera målsekvenser kommer man att hybridisera *två* (A och B) specifika oligonukleotider (prober) till varje målsekvens. Varje oligonukleotid har en primersekvens i sin ände som kan användas för PCR. Dessa två oligonukleotider binder till regioner på DNA:t som följer varandra vilket medför att de kan ihopfogas med ett **DNA-ligas**. Dock kommer denna ligering bara att gå om varje oligonukleotid perfekt har matchat sin sekvens. Dessutom har en av proberna en **stuffersekvens**. Stuffersekvensen är olika lång men alla primers och den DNA-bindande delen har samma längd. Anledningen till detta är för att man enkelt ska kunna sortera varje amplifierad produkt efter storlek senare. Målsekvenserna kommer ofta vara lika långa (förutsatt att det är ett bra C-G till A-T förhållande) så att man får en differens i stuffersekvensen. Därefter gör man en PCR-reaktion med hjälp av fluoroscensmärkta universella primers. Det är viktigt att målsekvenserna ligger nära varandra för att möjliggöra en ligering.

Question 36

Vid utredning av vilken sjukdom kan MLPA användas?

Answer 36

MLPA kan användas för att undersöka exempelvis DMD-genen. Om man har en misstanke om att en pojke har Duchennes utför man en MPLA. Då ser man ifall det kommer fattas någonting i DMD-genen.

Question 37

Vad är fördelen att använda sig av MLPA vid utredning av Duchennes sjukdom istället för vanlig PCR?

Answer 37

Detta beror på att PCR i sig inte är så kvantitativ, det är svårt att säga hur mycket mängd produkt man har i förhållande till någonting annat. I fallet med MLPA så kan man göra en kvantitativ analys, man vet hur mycket produkt man har i förhållande till någonting annat. Man kommer exempelvis se att det kanske finns mycket fragment som korresponderar för exon 47 men att det finns lite som korresponderar för exon 13 vilket tyder på en deletion. Antalet PCR-produkter kommer vara proportionellt till antalet ligeringsprodukter. Eftersom samma primers används kan man PCR-amplifiera alla ligeringsprodukter men med olika långa mellanliggande avsnitt (stuffer-sekvenser). Det är möjligt att utföra flera ligeringsreaktioner samtidigt i samma rör, så kallat multiplexing. Vid undersökning av DMD används en prob *för varje exon* i dystrofingenen. Man skulle då behöva 79 olika stuffersekvenser för att särskilja alla exon och därmed produkter efter storlek. MLPA har alltså fördelen mot PCR att det kan användas *kvantitativt*.

Question 38

Varför kan det vara bra att utreda systrar till pojkar som drabbats av Duchennes muskeldystrofi?

Answer 38

På sin ena X-kromosom har Lisa (b) samma deletion på hennes DMD-gen som sin bror men på sin andra kromosom är hon frisk. Det kan vara bra att veta eftersom heterozygoter också kan drabbas av muskelsvagheter och hjärtproblem i framtiden. Samtidigt är det också bra att veta om hon ämnar att skaffa barn eftersom hon har en 50% chans att ge X-kromosomen med deletionen till sitt barn vilket är särskilt problematiskt om hon får en pojke.

Question 39

Vilka 4 typer av NGS metoder finns det och vad är syftet med denna analys?

Answer 39

För NGS krävs det som alltid en patient och dess genom samt olika metoder för DNA-preparation och någon maskin för att generera sekvenser. Vad gäller NGS finns **helgenomsekvensering (WGS)**, **helexomsekvensering (WES)** där man bara undersöker de proteinkodande delarna av genomet och dessutom finns **genpaneler**. Det går även att sekvensera **RNA** för att avslöja närvaron och mängden RNA vid en viss tidpunkt. En **deletion**, en **insertion** eller en **missense** kommer kunna visualiseras med denna metod.

Question 40

Pair-end sequencing har använts här: vad kan man har skett i a, b, c och d?

Answer 40

A. Sekvensen från vardera ända av ett 2 kb fragment kommer ligga komplementärt och justerat efter referensgenomet B. Sekvenser som är 2 kb ifrån varandra i patientens DNA är 3 kb från varandra i referensgenomet. Patienten har haft en **deletion** på 1 kb någonstans i mellan paired ends C. Sekvenser som är 2 kb ifrån varandra i patientens DNA är 1 kb från varandra i referensgenomet. Patienter har haft en **insertion** på 1 kb någonstans i regionen mellan paired ends. D. Sekvenser som är orienterade i en viss riktning i patientens DNA är riktade åt motsatt håll i referensgenomet. Patienten har haft en **inversion** med en breakpoint mellan paired ends.

Question 41

Vad kan pair-end sequencing användas till?

Answer 41

Paired-end sequencing kan användas för att identifiera strukturella variationer. Det skall då ske en alignment mellan fragment och referenssekvensen för att kunna avgöra om det är en deletion, insertion eller inversion.

Question 42

Vilka 5 filtreringssteg kan man gå igenom för att begränsa varianter för undersökning av den sjukdomsorsakande?

Answer 42

För att hitta den sjukdomsorsakande varianten av en gen kan man gå igenom olika filtreringssteg: 1. Ta bort varianter vanliga i populationen - det finns databaser med vanliga varianter (dbSNP, 1000 genomes, ESP, ExAc, gnomAD) som man kan använda för detta 2. Fokusera på varianter som ger en aminosyraförändring, dvs. påverkar själva proteinet (som t.ex. ΔF508 för CFTR-genen). Kollar man för prolin kommer en mutation i tredje basparet i dess kodon inte att ge upphov till prolin i proteinet. Detsamma gäller för andra aminosyror. 3. Beroende på misstänkt nedärvningsmönster t.ex. recessiv homozygot alternativt sammansatt heterozygot kan man göra några filtrationer 4. Integrera kopplingsresultat för att få fram en kandidatregion. Man kollar vilka delar av genomet som liknar varandra. 5. Använda data från andra familjemedlemmar t.ex. friska/sjuka

Question 43

Vilka 5 fördelar finns det md NGS?

Answer 43

* Priserna har gått ned * Det går allt fortare att få fram resultat * Man kan hitta nya gener för olika sjukdomar * Man kan analysera ett stort antal kandidatgener * En stor fördel är att man kan få med stora gener som det var i princip omöjligt att sekvensera med Sangersekvensering som t.ex. TTN och NEB. Det är mer eller mindre nödvändigt att kombinera resultat från olika analyser och undersökningar.