4. Hur hittar man gener som orsakar Mendelska sjukdomar?

Question 1

Vad är ett locus, en allel, haplotyp respektive genotyp?

Answer 1

Locus​→ specifik plats i en kromosom där en specifik gen är lagrad.

Allel​→ genvariant för ett locus.

Haplotyp​→ samling alleler som ärvs av en förälder. Dessa ligger på samma kromosom.

Genotyp​→ individers alleler för ett locus eller flera loci.

Question 2

När används positionell kloning och vilka krav finns det för att kunna utföra detta?

Answer 2

Detta används för att detektera autosomalt dominanta​ sjukdomar.

➔ Krävs en stor familj

➔ Ritar upp ett diagram och sedan säkerställer man fenotypen hos olika individer.

➔ Samlar in DNA hos både friska och sjuka,

➔ Analys av hela genomet för att se vilka/vilket område som nedärvs tillsammans med sjukdom.

➔ Kolla om det finns kandidatgener, alltså gener som nedärvs som kan orsaka sjukdomen.

Question 3

Vilka 4 krav finns det på genetiska markörer?

Answer 3

➔ Vara jämnt utspridda över hela genomet och man måste känna till deras position.

➔ De måste vara ​polymorfa → ​finnas i flera olika alleler inom samma population.

➔ De olika allelerna måste vara relativt vanliga.

➔ Man måste känna till den exakta positionen för markören och veta lite om generna uppströms och nedströms.

Question 4

Vilka 2 genetiska markörer används och hur ser dessa ut?

Vilka fördelar och nackdelar finns det med dessa?

Answer 4

SNPs​ är en typ av markör. Här skiljer sig endast 1 bas och vi har cirka 10 miljoner sådana i vårt genom. För att analysera detta används ​SNP-microarrys​.

Mikrosatelliter​ är en annan typ av markör. Detta är Di-, tri- eller tetrarepeats. Vi har väldigt många sådana. Fördelen med dessa är att man kan enkelt urskilja de via PCR pga. olika längd. Nackdelen är dock att det är mer laborativt arbete.

Question 5

Vilket “personnummer” har SNPs och mikrosatelliter?

Answer 5

Både SNPs och mikrosatelliter har olika “personnummer”. SNPs:arnas personnummer brukar börja med ​rs​. Medan mikrosatelliternas börjar med ​D.

Question 6

Hur kan genetiska markörer användas för att hitta mutationer som är sjukdomsorsakande?

Answer 6

Varje kromosom har en unik kombination av alleler för alla markörer, men markörerna finns fortfarande där. Detta kan användas för att hitta området där sjukdomsgener sitter. Man kollar då på vilka markör-varianter som nedärvs tillsammans med sjukdomen. Genom att se vart dessa sitter kan man komma närmare och närmare sjukdomsgenen.

Markörer och alleler som ligger nära varandra har liten sannolikheten för överkorsning vid meios och brukar nedärvas tillsammans. Man säger att de är ​kopplade​.

När man letar efter sjukdomar utgår man alltså från markörer som ligger nära sjukdomsgenen.

Question 7

Vad innebär rekombinationsavståndet/genetiskt avstånd och hur beräknas det?

Hur skiljer det sig hos män och kvinnor?

Answer 7

Rekombenationsavståndet/Genetiskt avstånd​ beräknas på sannolikhet för överkorsning i meios. Detta mäts i centimorgan, 1cM innebär ungefär att det är 1% sannolikhet att det sker en överkorsning mellan de alleler man kollar på dvs. att de ej nedärvs tillsammans. Hos kvinnor sker fler överkorsningar än hos män.

Det finns vissa “hotspots” där rekombination sker betydligt oftare samt vissa ställen där det nästan aldrig sker någon överkorsning.

Question 8

Vad är rekombinationsavståndet hos män respektive kvinnor?

Answer 8

Hos kvinnor sker fler överkorsningar än hos män.

➔ Kvinnors cM→ 44-47cM

➔ Mäns cM→ 27 cM.

Question 9

Hur går kopplingsanalys till och vad används det till?

Vilka 2 typer av kopplingsanalyser finns det?

Answer 9

Vid ​kopplingsanalys​ letar man efter en gemensam genetisk region som nedärvs tillsammans med sjukdom. Man kollar på cirka 400 markörer som ligger utspridda över hela genomet. Kopplingsanalysen baseras på att man kollar på frekvensen av rekombination mellan dessa områden. Om det är hög rekombinationsfrekvens antas markörerna sitta långt ifrån varandra i genomet. Det finns två olika typer av kopplingsanalyser:

➔ Parametrisk kopplingsanalys

➔ Icke parametrisk kopplingsanalys

Question 10

Hur går parametrisk kopplingsanalys till och vad mäts det i?

Answer 10

Man tittar på markörerna och gör en statistisk beräkning → lod score → ​sannolikheten för att vissa markörer kommer nedärvas med sjukdomen. Om:

◆ Lod score>3 → 1000 ggr så stor sannolikheten att markören nedärvs tillsammans med sjukdomen,

◆ Lod score< -2 → markören nedärvs inte med sjukdomen.

Question 11

Vad kollar man på vid icke-parametrisk kopplingsanalys?

Answer 11

Man kollar på om alleler är IBD.

Question 12

Vad kallas den analys som görs efter kopplingsanalys och vad går den ut på?

Answer 12

Efter att man gjort en kopplingsanalys gör man en ​haplotypanalys. ​Man avgränsar sig då till ett område med högst Lod-score och kollar på flera markörer inom detta område.

Question 13

Hur användes kopplingsanalys för att hitta den sjukdomsorsakande mutationen för dyschromatosis?

Answer 13

Sjukdomen ​dyschromatosis​ hittades genom att man användes 343 markörer för hela genomet. Man fick då positiva load scores för kromosom 1. Man tittade senare på fler markörer i området och tittade på vart det finns haplotyp och vart det finns rekombination. Detta gör man genom att jämföra haplotyper mellan generationer och utesluta vart det ej kan ske rekombination. Vid dyschromatosis såg man att alla som blev sjuka hade mutationer i ​ADAR-genen​.

Question 14

Vad används kopplingsanalys främst till idag?

Answer 14

Fosterdiagnostik

Question 15

Vad används autozygosity mapping till och vad går det ut på?

Answer 15

Autozygosity mapping​ → används för att hitta recessiva sjukdomar. Hos familjer med konsangvinitet är det större sannolikhet för att de är homozygota för samma sjukdomsallel. Hos dessa familjer kollar man på genomiska homozygota områden. Man kollar på vilken kombination av markörer som nedärvs tillsammans.

Autozygosity→ ​homozygota för IBD, IBD​→ Identical by descent.

Denna metod kan användas vid jämförelse mellan flera mindre familjer med samma sjukdom. Detta då personerna (som är sjuka) borde vara homozygota för samma region i genomet.

Question 16

Vilka 2 analyser ingår i exome- och helgenomsekvensering och vilka fördelar finns det med dessa metoder?

Answer 16

Här ingår NGS och massive parallel sequencing. Det finns flera olika NGS men den största är Illumina. Fördelen med dessa tekniker är att det är billigare och att man kan göra en storskalig sekvensering snabbt.

Question 17

Vilka 3 typer av NGS utförs och vad är användningsområdet för respektive?

Answer 17

Target panel sequencing​ (40-200 gener) → görs på utvalda gener, det är billigt och har hög upplösning, man minskar även risken för bifynd.

Whole-exome sequencing​ (22 000 gener) → Upptäcker SNVs. Ett problem är dock att det är ojämn täckning, särskilt runt exon 1. Detta beror på hur exonet är uppbyggt.

Whole-genome sequencing (alla gener, translokationer och icke-kodande DNA) → ​Upptäcker SNV, SV och CNV i hela genomet.

Question 18

Fördelen med NGS är att man letar efter sjukdomsgener och mutationer samtidigt - vilken var en av de första sjukdomar som man hittade sjukdomsgenen mha denna metod?

Hur gick denna studien till och vilken gen var involverad?

Answer 18

En av de första sjukdomar som man kunde hitta sjukdomsgener med dessa tekniker är ​Kabuki syndrome​. Mutationerna är oftast de novo men ibland uppkommer de autosomalt dominant. Vid kabuki får man lite karaktäristiskt utseende. Man gjorde en studie på 10 personer och upptäckte att 9/10 av dessa hade mutationer i ​KMT2D​. KMT2D kodar för ett histon-metyltransferas, detta är viktigt för att kontrollera när gener ska va på/av.

Question 19

Vilka anledningar finns det till att ingen kandidatgen hittas efter sekvensering?

Answer 19

Det finns gånger som man inte hittar någon kandidatgen efter sin sekvensering. Detta kan bero på att sjukdomen är ​polygen​ eller ​komplex​. Ytterligare en anledning är att vi har platser i vårt genom som är svåra att sekvensera. Detta kan vara platser som är berikade med GC→ svårt att få täckning där. Sedan har vi även massvis med repeterande sekvenser som pseudogener etc. Sjukdomen kan också ligga i icke-kodande DNA vilket försvårar det.

Question 20

På vilka 6 sätt kan en mutation i icke-kodande DNA leda till sjukdom?

Answer 20

Sjukdomen kan ligga i icke-kodande DNA och detta kan ske genom att:

➔ Det uppstår kryptiska splice-sites→ ändring av proteinet. Detta är väldigt svårtolkat då det är svårt att se skillnad på 2 baser i ett genom som är uppbyggt av fler miljarder.

➔ Varianter i promotorregionen, dessa förändringar involverar också enstaka baser.

➔ UTR:s→ påverkar transkript-stabilitet.

➔ ncRNA→ icke kodande RNA. Dessa gener genererar ett RNA som sin slutprodukt.

➔ Repeat-expansion, blir svårt att fånga upp många repeats.

➔ Strukturella förändringar kan påverka genregleringen och förstöra en gen.

Question 21

Vilka 4 sätt kan man gå till väga på för att bevisa att den gen man har hittat är kopplad till sjukdomen?

Answer 21

Man kan ställa sig följande frågor/kolla på följande kontext:

1. Bedömning av funktionell relevans
2. Genkontext - När och var uttrycks den? Vilka proteiner interagerar den med?
3. Om det finns flera kandidatgener→ har de liknande funktion/samarbetar de - inblandade i samma pathway?
4. Funktionella studier

Question 22

När patienter har korta fingrar har de en ​deletion i ​EPHA4​ som ligger på kromosom 4 men personer som har ihopväxta fingrar har ​duplication​ och ​inversion​ en bit bort från den genen, och personer med flera fingrar har också strukturella förändringar en bit bort från genen - vad är anledningen till att detta påverkar fenotypen?

Answer 22

Även om genen är fullt fungerande har man fått markanta fenotypiska störningar vilket beror på att dessa mutationer ligger i gener som är viktiga för reglering av transkription och struktur.