Lezione L Flashcards
Perché nata l’esigenza di poter estrarre un lipopolisaccaride puro dalla cellula batterica ? Chi consentì lo sviluppo di tale tecnica ?
Da circa dieci anni si è scoperto il vero recettore dell’LPS (TRL4), per cui si è imposta l’esigenza di avere un LPS più puro, con una percentuale di contaminanti inferiore. Questo perché i recettori presenti sulla superficie delle cellule ospite hanno una diversa affinità per i diversi prodotti della cellula batterica. Se l’LPS tipico si lega a un recedere specifico (TRL4) e i LPS sono associati ai contaminanti, questi contaminanti possono stimolare anche altri recettori, come il TRL2 che ha un’affinità anche per altri componenti batterici. Di conseguenza ci chiediamo se la cascata di “signaling” dipende dall’LPS legatosi al TRL4 o dall’LPS e dal contaminante che, legandosi a recettori diversi, ha determinato un signaling risultante difficilmente definibile. Da qui è nata l’esigenza di avere un LPS ancora più puro. Tra il 2000 e il 2001 è uscito uno studio della scuola di Stephanie Gogel che si basava su un’estrazione doppia con acqua/fenolo, dove la miscela estratta veniva riestratta. Il contaminante scendeva allo 0.1% o anche inferiore a esso. L’LPS con un contaminante pari allo 0.1% viene considerato puro.
In quali tipi di batteri è presente il lipopolisaccaride e dove è localizzato ?
Nei batteri Gram-negativi l’outer membrane (membrana esterna), presente solo nei gram-negatvi è costituita da da: -‐ un foglie’o interno che contiene fosfolipidi; -‐ un foglietto esterno che contiene LPS inframmezzato a proteine dai ruoli strutturali o funzionali quali porine che possono far passare sostanze idrofile.
Il LPS è una struttura complessa, costruita dall’interno verso l’esterno da: -‐ lipide A, ancorato al foglietto esterno della membrana esterna; -‐ core costruito da zuccheri e diviso in inner core e outer core; -‐ angene o polisaccaride O.
Qual’è la componente tossica del lipopolisaccaride ? Qual’è il suo grado di variabilità strutturale ?
Il lipide A è il principio tossico. L’endotossina non va confusa con il lipide A, perché quest’ultimo è solo una parte dell’LPS che insieme ai contaminanti costituisce l’endotossina. Il lipide A tipico è quello che ha tutti gli effetti biologici dell’LPS batterici, e lo si ritrova nelle Enterobattereace, esso è estremamente conservato strutturalmente nella maggioranza dei batteri gram-negativi con piccolissime variazioni: Ci sono anche lipidi A atipici.
Cosa distingue un lipide A tipico da uno atipico ? Quale dei due è più tossico ?
L’optimum e l’acido beta idrossi-miristico che hanno rispettivamente 14 atomi di c12 e 16 atomi di carbonio sono comuni nel lipide A tipico. Un acido grasso di 18 atomi di C lo si ritrova in quelli atipici. Un lipide A per essere tipico, per esprimere tutte le caratteristiche fisico/chimiche ma sopratutto biologiche, deve avere questa struttura. Essa consente di avere una buona attività biologica sia in vivo che in vitro. Un LPS di questo genere, come quello di E. coli o Salmonella, ha una dose letale di 15/20 mg. Mentre per LPS atipici, la dose letale aumenta di dieci o anche cento volte, quindi l’LPS atipico è meno tossico. Quello tipico è più potente.
Come è strutturato il Polisaccaride O del LPS ? Ha una composizione omologa o variabile tra le varie specie batteriche ?
Il polisaccaride O è costituito da una sequenza ripetuta di piccole subunità di 3, 4 o 5 zuccheri molto semplici come glucosio, galattosio, arabinosio, glucosammina, galattosammina ecc. (sono comunque generalmente esosi), che si ripetono sempre identiche un numero n di volte, dove n può arrivare fino a 50. La variabilità delle possibili combinazioni della sequenza glucidica ed il numero di volte che si ripete (n) è molto alta. Questo significa che all’interno dello stesso genere ad esempio Salmonella, e all’interno della stessa specie, ad esempio nella specie tifi (Salmonella Tifi) possono presentarsi sierotipi diversi. La variabilità sierotipica è basata sulla variabilità del polisaccaride O. Il polisaccaride O è la parte meno conservata cioè più variabile dell’LPS, ciò gli consente di essere un buon antigene, anche se è di natura polisaccaridica e non proteica (le proteine hanno un’altissima variabilità). Il polisaccaride O viene riconosciuto da antisieri cioè anticorpi specifici. Ciò si rivela molto importante, infatti con le normali prove biochimiche si riesce a individuare solo il genere, ad esempio Salmonella e non la specie. La Salmonella tifi determina il Tifo addominale (una volta chiamato tifo nero) che porta a morte. Salmonella paratifi, è un agente eziologico di malattie meno gravi, che determina ad e il paratifo A o B, ma non porta alla morte.
Quale sono le attuali tecniche d’elezione usate per determinare il genere e la specie batterica isolata ? Come si procede per identificare Salmonella Tifi e determinare a quale sierotipo è appartenente ?
L’identificazione batterica si esegue in prima istanza sempre con le prove biochimiche, e solo in un secondo momento si fa uso di antisieri. Si offrono 32 substrati al batterio, ed entro 24 o 48 ore, il batterio metabolizza i substrati in maniera peculiare, ad esempio uno sì, uno no. I risultati riportati su un computer indicano con una percentuale di probabilità di che batterio si tratta, ad esempio al 99% è Salmonella. A questo punto bisogna avere una serie di antisieri (cioè anticorpi) per il tifo; il paratifo a; il paratifo b: si infettano i batteri con questi antisieri e in questo modo si identificherà anche la specie. Per altri batt come Pseudomonas, E.coli, basteranno solo le 32 prove biochimiche.
Questo sottolinea ciò serve l’importanza della variabilità del polisaccaride O.
Descrivi la struttura e le caratteristiche del core del lipopolisaccaride, è una struttura variabile o conservata ? Quali sono i suoi chemotipi principali ?
Osservando i core di chemotipi Ra, Rb, Rc, Rd, Re si noti che passando dal chemotipo Ra a quello Re, gli zuccheri diminuiscono. Ciò determina una variabilità dovuta non solo alle caratteristiche del chemotipo in se, ma anche ad esempio al fato che il batterio portatore di un LPS con chemotipo Ra non avrà il polisaccaride O. In questo caso si chiamerà “LPS rough” (rugoso), chiamato così perché la colonia a occhio nudo presenta un contorno non “smooth”cioè non liscio, ma rugoso. Gli LPS rugosi sono quelli senza polisaccaride O. Se manca il polisaccaride O la variabilità è data dal core. Negli anni ’70 si fecero molti studi per capire come mai esistessero dei ceppi con core sempre più corti. Il più studiato è il chemotipo Re composto soltanto da un tre molecole di KDO (legate ad una glucosammina del lipide A); Questo chemotipo prende il nome di “deep rough”, profondamente rugoso, perché presenta solo il lipide A e tre molecole di KDO, mancano il polisaccaride O, il core esterno e il contaminante proteico. L’effetto tossico non è inficiato perché il lipide A, che è il principio tossico, è preservato.
Cosa determina l’aspetto del contorno “smooth” o “rough” (liscio o rugoso), osservabile ad occhio nudo, di una colonia batterica ? Che struttura ha un LPS che determina un aspetto “deep smooth” ?
La presenza o l’assenza del polisaccaride O legato al core del’LPS.
Il chemotipo Re del core, prende il nome di “deep rough” profondamente rugoso, perché presenta solo il lipide A e tre molecole di KDO, mancano il polisaccaride O, il core esterno e il contaminante proteico. (L’effetto tossico non è inficiato perché il lipide A, che è il principio tossico, è preservato).
Comè composto il lipide A ?
Il lipide A è costruito da due zuccheri: 2 glucosammine. In posizione 2 troviamo il gruppo amminico (NH) che giusfica il nome dello zucchero. Su ogni lato troviamo cascuna glucosammina può legare un gruppo fosfato, ma la presenza di un secondo gruppo fosfato è facoltativa. Importante per la struttura del lipide A sono gli acidi grassi che ad esempio in E. coli, sono disposti in maniera asimmetrica: 2 sono legati a una glucosammina, 4 all’altra. Gli acidi grassi sono saturi (mancano i doppi legami) e sono di media lunghezza. L’optimum è l’acido beta idrossi-miristico che hanno rispettivamente 14 atomi di c12 e 16 atomi di carbonio sono comuni nel lipide A tipico. Ma ci possono essere delle eccezioni.
Perché la diversità del chemotipo del core determina la presenza o l’assenza del polisaccaride O ? Quali sono tutte le conseguenze ha questa variabile sul microrganismo ?
I diversi fenotipi del core (Ra > Rb > Rc > Rd > Re) sono il risultato di un difetto genotipico sempre più grave per il batterio, poiché manca o non funziona il gene che codifica per l’enzima deputato al legame del polisaccaride O in via di sintesi al core. Se manca il gene o non funziona, il ceppo è geneticamente predestinato a sviluppare un LPS rough. Ad esempio nel caso di Rb ci saranno tutti gli enzimi biosintetici responsabili della sintesi del lipide A, della sintesi del KDO e delle molecole di Hop, della sintesi della parte più interna dell’inner core; ma mancano quelli responsabili del legame al core delle molecole più esterne che servono per il legame con il polisaccaride O.
Gli enzimi di questo pathway biosintetico mancano perché manca il gene o non funziona. Questo è importante perché possiamo capire il ruolo delle varie parti dell’LPS: infatti è stato individuato in Salmonella un ceppo progenitore, wild, con la struttura completa dell’LPS e un ceppo mutante, geneticamente deficitario. Paragonando l’attività biologica del ceppo wild con quella del ceppo mutante, si è potuto capire il ruolo del polisaccaride O. La mancanza del polisaccaride O non inficia l’effetto tossico del ceppo mutante, in quanto il polisaccaride O non ha funzione da un punto di vista tossico. Il polisaccaride O, invece, è importante da un punto di vista diagnostico perchè ci sono antisieri molto specifici che lo legano, si può quindi individuare, con studi sierologici, il batterio che causa una determinata malattia quando le indagini molecolari non sono sufficienti.
Come si è arrivati a determinare che l’attività tossica del lipopolisaccaride è (quasi) sempre determinata dal lipide A ? Che ruolo hanno biologico e diagnostico hanno, invece, il core ed il polisaccaride O in vivo ed in vitro ?
Grazie ai difetti genetici che determinano la presenza o l’assenza del polisaccaride O: in Salmonella è stato individuato un ceppo progenitore, wild, con la struttura completa dell’LPS e un ceppo mutante, geneticamente deficitario. Paragonando l’attività biologica del ceppo wild con quella del ceppo mutante si è potuto capire il ruolo del polisaccaride O. La mancanza del polisaccaride O non inficia l’effetto tossico del ceppo mutante, in quanto il polisaccaride O non ha funzione da un punto di vista tossico. Il polisaccaride O è importante da un punto di vista diagnostico perché ci sono antisieri molto specifici che lo legano, si può quindi individuare il batterio che causa una determinata malattia. Nel caso in cui mancasse il polisaccaride O, sarebbe necessario avere antisieri contro il core, ma mentre il polisaccaride O è più lungo e la sua variabilità consente di avere antisieri molto più specifici; a mano a mano che si accorcia la struttura si riduce la variabilità e quindi si riduce il suo potenziale antigenico. Il siero non riesce a distinguere un “deep rough” dall’altro, perché la variabilità non è alta.
La spiccata variabilità consente da un punto di vista patodiagnostico di riconoscere un batterio dall’altro, ma il ruolo del polisaccaride O nella genesi della patologia è molto modesto. Infatti alcuni batteriologi ritengono che gli esperimenti non si devono fare con gli LPS deep rough, soprattutto in vivo, perché sono meno attivi: I LPS deep rough mancano di una lunga catena idrofilica, quanto si inietta l’LPS nel ratto non verrà prontamente trasportato perchè essendo idrofobico formerà micelle, per cui non si ha la farmaco-cinetica completa dell’LPS; in seguito le micelle verranno sequestrate e difficilmente l’LPS arriverà al recettore a cui deve arrivare. Queste sono considerazioni fisico-chimiche e farmaco-cinetiche riscontrate in vivo, ma in vitro la differenza è modesta.
Per quali tipi batterici è opportuno usare la tecnica di Galanos (1969) per l’estrazione del LPS ? Come si esegue e perchè ?
La tecnica di Galanos si basa su una miscela di fenolo, cloroformio ed eteri di petrolio. La tecnica è usata per individuare ceppi che pur non essendo deep rough, hanno un LPS atipico con un polisaccaride O poco rappresentato. Ad esempio per Clamidia e Neisseria si parla di lipooligosaccaride. Di seguito viene descritta l’estrazione di LPS con acqua/fenolo: Estrazione significa separazione in fasi, alla fine di questa estrazione si ottengono quattro fasi. Dal basso verso l’alto si ottiene una fase grigiastra, in cui vi sono i detriti cellulari, cioè quelle sostanze che sono corpuscolate e che non sono state estratte. Poi vi è una fase marrone chiaro che è la fase fenolica. Più in alto vi è la fase cremosa, di colore panna, con i fosfolipidi e piccole parte di detriti cellulari e infine la fase acquosa con l’LPS.
A questo punto ci si chiede come mai l’LPS si trova nella fase acquosa pur essendo di natura lipidica. Se il polisaccaride O è ben rappresentato il LPS si trova nella fase acquosa perché viene “sradicato” dalla membrana esterna per mezzo dal polisaccaride O, ben rappresentato e fortemente idrofilo. Se invece il ceppo è profondamente rugoso, e quindi il polisaccaride O è assente, l’LPS non andrà nella fase acquosa. In realtà una piccola parte sarà portata nella fase acquosa dagli zuccheri del core, ma la maggior parte dell’LPS si accumulerà in parte nella fase cremosa e in parte nella fase fenolica. In questa tecnica si usa una miscela di sostanze liposolubili, a eccezione del fenolo. Nella tecnica di Galanos si prepara la miscela e si aggiungono le cellule batteriche, si forma una mistura in cui si deve isolare l’LPS. Facendo cadere l’acqua goccia a goccia si arriva ad un momento in cui il lipopolisaccaride, di natura lipidica, non riesce più a stare in soluzione e quindi precipita, si vedono quindi delle gocce chiare. È una procedura molto lunga, ma la resa è eccellente, 0.1 – 1% di contaminante.
Perché il LPS viene estratto talvolta anche con la tecnica butanolica anche se la resa del contaminante è di circa il 40% ? Qual’è invece la tecnica più recente per avere un LPS puro ?
Nella tecnica che si basa sul butanolo, si ha una resa di contaminante pari al 40%, che è molto alta. Si rivela utile, tuttavia, nell’estrazione dell’LPS a scopo vaccinale. In questo caso si ha necessità di aumentare il potere antigenico, quindi la componente proteica deve essere elevata.
La tecnica di Hirschifeld, studiata nel 2000/2001, si basa su una doppia estrazione con acqua/fenolo, in cui si ha una resa dello 0.05%.
Quali sono le caratteristiche che rendono un lipide A un antagonista recettoriale ? Quale batterio ad esempio le possiede ?
In B. henselae ci sono i 2 gruppi fosfato, ci sono due dideossi-Dglucosamine e c’è un acido grasso a catena lunga con 26/28 atomi di C. Ha 5 acidi grassi, il ché inficia molto il potere tossico.
Lo scheletro costruito da dideossi-Dglucosamina, da 5 acidi grassi e da una catena lunga fa sì che il lipide A si comporti da antagonista e inganni il recettore. Lo blocca e quando arriva l’LPS delle Enterobattereace come Pseudomonas lo trova occupato. Questo fenomeno è detto occupazione sterica, perché il lipide occupa il recettore ma manca dell’effetto tossico specifico, che viene definita attività intrinseca. Una sostanza che ha affinità elevata per il recettore, ma manca di attività intrinseca, è un antagonista recettoriale. Questo si rivela importante nel caso degli antagonisti farmacologici.
Fornisci tre esempi di lipide A che a causa delle sue modifiche strutturali risulta meno tossico. Quali sono le caratteristiche che diminuiscono la tossicità della struttura.
Nel lipide A della Chlamydia trachomatis, ci sono le due glucosammine con i due gruppi amminici e i 2 gruppi fosfato. Turavia ci sono 5 acidi grassi, il che riduce dalle 10 alle 100 volte la potenza endotossica. Per avere un’alta potenza endotossica, devono esserci almeno sei acidi grassi. Inoltre uno degli acidi grassi ha una catena medio-lunga, di 20 atomi di C, quindi non ottimale per un’alta tossicità. Si traDa di una struDura abbastanza atipica rispetto a E.coli o Salmonella.
In Legionella pneumophila, non ci sono le glucosammine, ma le dideossi-Dglucosammine, in quanto per ognuna di esse, il gruppo ossidrilico in posizione 3 è stato sostituito da un gruppo amminico, quindi per ogni dideossi-Dglucosammina abbiamo due gruppi amminici in posizione 2 e 3. Sono presenti i due gruppi fosfato come da regola e sei acidi grassi. Tuttavia vi è una catena di 18 atomi di C e una di 28, si tratta di una catena troppo lunga.
Il Porphyromonas gingivalis è l’agente eziologico della parodontite. Questo è un batterio anaerobio del cavo orale. Esso presenta 5 acidi grassi, alcuni dei quali presentano un numero dispari di atomi di C (17). Anche il numero dispari inficia l’effetto patogeno, anche se non in modo grave. C’è un solo gruppo fosfato, il che abbassa notevolmente l’effetto tossico.
Una lunghezza delle catene di carbonio maggiore della media, un numero dispari di atomi di C delle stesse, la presenza dideossi-Dglucosammina, la mancanza di gruppi fosfato e un numero di catene di acidi grassi pari a 5 o comunque minore di 6 rendono il lipide A meno tossico.
