Les techniques pour étudier les protéines Flashcards
Que faut-il obtenir avant de pouvoir étudier une protéine?
obtenir la quantité nécessaire de protéine purifiée pour nos expériences
Vrai ou faux
Dans la majorité des études modernes, des protéines recombinantes ne sont pas beaucoup exprimées
Faux, surexprimées
Quelle bactérie est utilisée pour la surexpression des protéines?
E. coli
Qu’amène la surexpression de protéines?
- Production rapide de quantité adéquate de protéines
- Facilite la purification
Quelle est la règle d’or #1?
«shit in… shit out»
Protéines doivent normalement être purifiées avant d’être étudiées
Pourquoi les protéines doivent être purifiées avant d’être étudiées?
- Protéine non purifiée peut donner des résultats faussés
- Niveau de pureté nécessaire dépend de la technique qui sera utilisé.
- Pureté minimal = une seule bande sur un gel SDS-PAGE
Comment obtient-on le gène pour la construction du vecteur d’expression?
- PCR à partir d’ADNc ou d’ADN génomique
- Construction d’un vecteur d’expression qui permet de surexprimer dans un hôte
- incorporation d’un tag pour la purification
- Vérification de la séquence du vecteur d’expression
Pourquoi un système bactérien n’est pas toujours adéquat pour des protéines eucaryotes?
Quelle est la solution?
- ponts disulphures
- modifications ppost-traductionnelle
Levure, cellule d’insecte, cellule animale
Que peut être le tag incorporer?
His-tag, GST-tag
Quelles sont les étapes/conditions pour la surexpression de la protéine recombinante?
‣ Choix du milieu de culture
• milieu riche
• milieu minimal pour marquer la protéine
• marquage potentiel
‣ Optimisation des conditions de croissance cellulaire
‣ Optimisation des conditions d’induction à l’IPTG.
‣ Optimisation de la température d’incubation.
• protéines solubles
• minimisation des corps d’inclusion
‣ Surexpression à grand volume
• 250mL – 10L
‣ Extraction de la protéine soluble (ou des corps d’inclusion)
Quelle technique est principalement utilisée pour la purification?
la chromatographie
- interactions ioniques
- Volume hydrodynamique (exclusions stérique)
- affinité
Par quoi la purification peut-elle être facilitée?
l’utilisation d’un tag en N- ou C-terminal
Que faut-il éviter ou essayer de faire avec le tag?
- ne doit pas affecter la fonction
- élimination du tag si possible
Quelles sont les 3 étapes pour l’obtention d’une protéine?
- Obtention du gène et construction du vecteur d’expression
- Surexpression de la protéine recombinante
- Purification
Définir spectroscopie
analyse en détectant l’interaction entre une radiation électromagnétique et un échantillon
Vrai ou faux
la spectroscopie couvre un large spectre de fréquence
Vrai
Quelles sont les caractéristiques de la spectroscopie infrarouge?
Fréquence : 30-120 THz
interactions avec les vibrations de liens
Possible d’obtenir de l’info de base pour distinguer hélices a et feuillets b
Vrai ou faux
l’infrarouge est la plus utile pour les prots
Faux, UV/vis
Quel info est donné par la promotion d’un electron dans une orbitale excité suivi d’un retour à l’équilibre très rapide?
info sur les electrons et leur énergie
électrons = liaison donc donne de l’info sur les liaisons dans les protéines
Vrai ou faux
La radiation uv/vis est principalement absorbée par des groupements aromatiques
Vrai
uv/vis est absorbé par des…
Chromophores
Par quoi est exprimée la capacité à absorber l’uv/vis
le coefficient d’exctinction molaire et la longueur d’onde max
à cmb absorbe l’eau?
180nm
Vrai ou faux
Plusieurs cofacteurs absorbent l’uv
Vrai
L’absorbance uv/vis peut être utilisée pour suivre…
une réaction si le substrat et le produit absorbe différemment
pour suivre le repliement
Quelles sont les caractéristiques du dichroisme circulaire?
- Utilise la radiation uv pour détecter les molécules/structures chirales
- Utilise la radiation UV qui est polarisée
- Mesure la différence d’absorption de la lumière lorsque sa polarisation circulaire est droite ou gauche
Vrai ou faux
Les structures secondaires présentent des valeurs de DC caractéristiques
Vrai
Vrai ou faux
Le DC donne les emplacements des structures secondaires détectée
faux
Pour quoi est très efficace le DC?
observer les modifications des conformations
Aspect thermodynamique de la molécule
pour quoi est utile le DC?
réduire énormément les possibilités de structure de la protéine étudiée
Quels sont les avantages du DC?
faire des mesures rapidement, pas de grande quantité de protéines, pas d’analyse complexes de données
Vrai ou faux
Les protéines sont généralement fluorescentes
Faux, très peu
définir mesures hydrodynamiques
Groupe de méthodes permettant de mesurer la grosseur et la forme des protéines, l’état oligomérique, l’état de complexes
Quelles sont les méthodes utilisées pour les mesures hydrodynamiques?
Filtration sur gel (chromato d’exclusion stérique)
Gel natif page
Diffusion dynamique de la lumière
Diffusion des rayons x aux petits angles
RMN
La fonction d’une protéine est strictement déterminée…
Par sa structure
Donne les étapes d’une détermination de structure par RMN
- préparation des échantillons appropriés
- Acquisition de plusieurs spectres RMN
- Attribution des déplacements chimiques
- Obtenir des contraintes structurales
- > distance inter-protons
- > angles dièdres
- > Autres
- Générer une structure qui satisfait les contraintes structurales
La RMN se fonde sur…
les propriétés magnétiques des noyaux atomiques
Pour quoi est utile la RMN 1D?
-petites molécules
Pour quoi est utile la RMN 2D?
protéine <8kD
Pour quoi sont utiles les RMN 3 et 4D?
- majorité ses déterminations de structures
- Permet une attribution quasi-complète
Qu’est ce que la contrainte NOE?
mesure de la distance entre 2 protons
Qu’est ce que la contrainte J?
mesure un angle dièdre (constante de coulage
Quelle contrainte mesure les ponts H?
déplacements chimique
Quels instruments sont nécessaires en RMN?
syst;me computationnelle, Console RMN, aimant et magnet console interface
Décrire le principe d’un aimant supra-conducteur
- Génération de champs magnétiques important
- Bobine d’un fil conducteur très fin en alliage spécial plongée dans un dewar contenant de l’hélium liquide à -296C
- Entouré d’un second dewar avec de l’azote liquide à -196C
- T = résistence du fil conducteur = nulle -> ampérage cicrculant dans la bobine peut donc être important
