Les techniques pour étudier les protéines

Question 1

Que faut-il obtenir avant de pouvoir étudier une protéine?

Answer 1

obtenir la quantité nécessaire de protéine purifiée pour nos expériences

Question 2

Vrai ou faux

Dans la majorité des études modernes, des protéines recombinantes ne sont pas beaucoup exprimées

Answer 2

Faux, surexprimées

Question 3

Quelle bactérie est utilisée pour la surexpression des protéines?

Answer 3

E. coli

Question 4

Qu’amène la surexpression de protéines?

Answer 4

• Production rapide de quantité adéquate de protéines

- Facilite la purification

Question 5

Quelle est la règle d’or #1?

Answer 5

«shit in… shit out»

Protéines doivent normalement être purifiées avant d’être étudiées

Question 6

Pourquoi les protéines doivent être purifiées avant d’être étudiées?

Answer 6

• Protéine non purifiée peut donner des résultats faussés
• Niveau de pureté nécessaire dépend de la technique qui sera utilisé.
• Pureté minimal = une seule bande sur un gel SDS-PAGE

Question 7

Comment obtient-on le gène pour la construction du vecteur d’expression?

Answer 7

• PCR à partir d’ADNc ou d’ADN génomique
• Construction d’un vecteur d’expression qui permet de surexprimer dans un hôte
• incorporation d’un tag pour la purification
• Vérification de la séquence du vecteur d’expression

Question 8

Pourquoi un système bactérien n’est pas toujours adéquat pour des protéines eucaryotes?
Quelle est la solution?

Answer 8

• ponts disulphures
• modifications ppost-traductionnelle

Levure, cellule d’insecte, cellule animale

Question 9

Que peut être le tag incorporer?

Answer 9

His-tag, GST-tag

Question 10

Quelles sont les étapes/conditions pour la surexpression de la protéine recombinante?

Answer 10

‣ Choix du milieu de culture
• milieu riche
• milieu minimal pour marquer la protéine
• marquage potentiel
‣ Optimisation des conditions de croissance cellulaire
‣ Optimisation des conditions d’induction à l’IPTG.
‣ Optimisation de la température d’incubation.
• protéines solubles
• minimisation des corps d’inclusion
‣ Surexpression à grand volume
• 250mL – 10L
‣ Extraction de la protéine soluble (ou des corps d’inclusion)

Question 11

Quelle technique est principalement utilisée pour la purification?

Answer 11

la chromatographie

• interactions ioniques
• Volume hydrodynamique (exclusions stérique)
• affinité

Question 12

Par quoi la purification peut-elle être facilitée?

Answer 12

l’utilisation d’un tag en N- ou C-terminal

Question 13

Que faut-il éviter ou essayer de faire avec le tag?

Answer 13

• ne doit pas affecter la fonction

- élimination du tag si possible

Question 14

Quelles sont les 3 étapes pour l’obtention d’une protéine?

Answer 14

1. Obtention du gène et construction du vecteur d’expression
2. Surexpression de la protéine recombinante
3. Purification

Question 15

Définir spectroscopie

Answer 15

analyse en détectant l’interaction entre une radiation électromagnétique et un échantillon

Question 16

Vrai ou faux

la spectroscopie couvre un large spectre de fréquence

Answer 16

Vrai

Question 17

Quelles sont les caractéristiques de la spectroscopie infrarouge?

Answer 17

Fréquence : 30-120 THz
interactions avec les vibrations de liens
Possible d’obtenir de l’info de base pour distinguer hélices a et feuillets b

Question 18

Vrai ou faux

l’infrarouge est la plus utile pour les prots

Answer 18

Faux, UV/vis

Question 19

Quel info est donné par la promotion d’un electron dans une orbitale excité suivi d’un retour à l’équilibre très rapide?

Answer 19

info sur les electrons et leur énergie

électrons = liaison donc donne de l’info sur les liaisons dans les protéines

Question 20

Vrai ou faux

La radiation uv/vis est principalement absorbée par des groupements aromatiques

Answer 20

Vrai

Question 21

uv/vis est absorbé par des…

Answer 21

Chromophores

Question 22

Par quoi est exprimée la capacité à absorber l’uv/vis

Answer 22

le coefficient d’exctinction molaire et la longueur d’onde max

Question 23

à cmb absorbe l’eau?

Answer 23

180nm

Question 24

Vrai ou faux

Plusieurs cofacteurs absorbent l’uv

Answer 24

Vrai

Question 25

L’absorbance uv/vis peut être utilisée pour suivre…

Answer 25

une réaction si le substrat et le produit absorbe différemment
pour suivre le repliement

Question 26

Quelles sont les caractéristiques du dichroisme circulaire?

Answer 26

• Utilise la radiation uv pour détecter les molécules/structures chirales
• Utilise la radiation UV qui est polarisée
• Mesure la différence d’absorption de la lumière lorsque sa polarisation circulaire est droite ou gauche

Question 27

Vrai ou faux

Les structures secondaires présentent des valeurs de DC caractéristiques

Answer 27

Vrai

Question 28

Vrai ou faux

Le DC donne les emplacements des structures secondaires détectée

Answer 28

faux

Question 29

Pour quoi est très efficace le DC?

Answer 29

observer les modifications des conformations

Aspect thermodynamique de la molécule

Question 30

pour quoi est utile le DC?

Answer 30

réduire énormément les possibilités de structure de la protéine étudiée

Question 31

Quels sont les avantages du DC?

Answer 31

faire des mesures rapidement, pas de grande quantité de protéines, pas d’analyse complexes de données

Question 32

Vrai ou faux

Les protéines sont généralement fluorescentes

Answer 32

Faux, très peu

Question 33

définir mesures hydrodynamiques

Answer 33

Groupe de méthodes permettant de mesurer la grosseur et la forme des protéines, l’état oligomérique, l’état de complexes

Question 34

Quelles sont les méthodes utilisées pour les mesures hydrodynamiques?

Answer 34

Filtration sur gel (chromato d’exclusion stérique)
Gel natif page
Diffusion dynamique de la lumière
Diffusion des rayons x aux petits angles
RMN

Question 35

La fonction d’une protéine est strictement déterminée…

Answer 35

Par sa structure

Question 36

Donne les étapes d’une détermination de structure par RMN

Answer 36

• préparation des échantillons appropriés
• Acquisition de plusieurs spectres RMN
• Attribution des déplacements chimiques
• Obtenir des contraintes structurales
• > distance inter-protons
• > angles dièdres
• > Autres
• Générer une structure qui satisfait les contraintes structurales

Question 37

La RMN se fonde sur…

Answer 37

les propriétés magnétiques des noyaux atomiques

Question 38

Pour quoi est utile la RMN 1D?

Answer 38

-petites molécules

Question 39

Pour quoi est utile la RMN 2D?

Answer 39

protéine <8kD

Question 40

Pour quoi sont utiles les RMN 3 et 4D?

Answer 40

• majorité ses déterminations de structures

- Permet une attribution quasi-complète

Question 41

Qu’est ce que la contrainte NOE?

Answer 41

mesure de la distance entre 2 protons

Question 42

Qu’est ce que la contrainte J?

Answer 42

mesure un angle dièdre (constante de coulage

Question 43

Quelle contrainte mesure les ponts H?

Answer 43

déplacements chimique

Question 44

Quels instruments sont nécessaires en RMN?

Answer 44

syst;me computationnelle, Console RMN, aimant et magnet console interface

Question 45

Décrire le principe d’un aimant supra-conducteur

Answer 45

• Génération de champs magnétiques important
• Bobine d’un fil conducteur très fin en alliage spécial plongée dans un dewar contenant de l’hélium liquide à -296C
• Entouré d’un second dewar avec de l’azote liquide à -196C
• T = résistence du fil conducteur = nulle -> ampérage cicrculant dans la bobine peut donc être important