HC+WC Analyse Flashcards
Wet van Lambert-beer en hoe pas je het toe
A = log (I0 /I) = E l c
- Je maakt referenties waarvan je de exacte concentraties weet –> via lamber-beer bereken je de molaire extinctiecoefficient
- Vervolgens meet je de extinctie van je eigen oplossing
Welke zijketens van aminozuren absorberen meeste licht? (bij 280 nm)
- Tryptofaan
- Tyrosine
- Fenylalanine
Cysteïne zelf absorbeert geen licht, maar Cystine wel. Die is met een disulfidebrug verbonden
Wat is tricky bij UV-meting?
Je gaat er bij zo een meting altijd vanuit dat de optische dichtheid (het verdwijnen van licht), dat dat gerelateerd is aan de absorptie. Echter, eiwitten zijn relatief grote structuren en die kunnen aggregeren. Deze grote aggregaten kunnen zorgen voor verstrooiing waardoor je een hele hoge absorptie meet. Dan denk je dat je een hele hoge concentratie aan eiwit hebt, maar je hebt een lage concentratie met aggregaten.
Als een eiwit bijv ontdooid is en dan weer gevroren, kan er ontvouwing zijn van de eiwitten. De hydrofobe delen komen dan open te liggen waardoor ze kunnen aggregeren
- Niet meer werkzaam
- Kunnen immuunreactie oproepen
Optische dichtheid (verdwijnen van licht) = ………. + ……….
Absorptie + lichtverstrooiing
Waar is lichtverstrooiing afhankelijk van?
- Grootte aggregaten (hoe groter, hoe meer verstrooiing)
- hydrodynamische diameter (10^6, dus iets is 2x groter dan vergroting licht verstrooiing 2x10^6, GAAT ENORM SNEL)
- golflengte van het licht waarbij je aan het meten bent (hoe groter de golflengte, hoe kleiner de effect van de licht verstrooiing is, niet helemaal lineair, afhankelijk van de golflengte)
Wat is een EIS bij UV-meting?
De oplossing MOET wel helder zijn.
- Als het niet helder is, meet je hele hoge absorptie, maar dat is dan niet door het eiwit zelf, maar door de licht verstrooiing
Hoe kun je vaststellen of je last hebt van lichtverstrooiing?
- Als je hoger dan je basislijn uitkomt
UITLEG: als golflengte groter wordt, wordt de bijdrage van licht verstrooiing steeds minder totdat het 0 wordt (zie grafiek hiervoor) als je dus ziet dat die niet meer bij de basislijn (0) komt, dan heb je lichtverstrooiing
OP deze manier kijken naar je spectrum en vaststellen of je wel of niet licht verstrooiing ziet
HIERMEE dus te bepalen: zijn mijn eiwitten nog in oplossing? (veel lichtverstrooiing > aggregaten > eiwitten niet in oplossing)
Verandering aan spectrum?
Over het algemeen geven suikergroepen (als eiwit geglycosyleerd is) geen absorptie bij 280 nm
methylering/acetylering geven ook niks extras
Eiwitgehalte bepalen
- Algemene eiwitkleuring
(lowry, bradford, BCA…) - Specifiek
(ELISA, HPLC-UV/MS, CE…)
Wat is belangrijk bij algemene eiwitkleuring?
Als je eiwit hebt, heb je altijd aminozuren en die aminozuren zijn verbonden met een amideverbinding
Die amidebinding kun je meten bij een relatief lage golflengte (dus niet heel selectief) (amindebinding 214 nm)
Als je kleurtje gaat meten, dan kun je ook last krijgen van de achtergrond. Het kleurtje die je krijgt kan ook verkregen worden door andere stoffen in je preparaat. Wat je dan doet is een blanco meting maken. Je doet er alles in behalve je eiwit. kijken of je het kleurte weer krijgt
SEC
= HPLC waar een extra kolom tussen zit, die kolom is geschikt voor je eiwitten. HPLC zelf zou verstoppen als je er eiwitten in zou doen (te groot)
- Scheiding op basis van grootte (niet alleen Mw maar ook hydrodynamische straal)
- -> Grote eiwitten komen er het snelst uit
Grotere eiwitten komen dus als eerste uit de kolom, nog grotere eiwitten komen even snel, daar wordt geen onderscheid tussen gemaakt hele kleine moleculen komen er aan het einde tegelijk uit, dit heet de ondergrens
Je ziet hier piek, nog later dan de ondergrens –> eiwit
gebonden aan de kolom, dan heb je dus niet alleen
scheiding obv grootte, maar dan heb je ook scheiding obv binding
Vroeger werd silica in de kolom gebruikt, waarom nu niet meer?
Silica heeft een negatieve lading –> als je eiwit dan positieve lading had, bindt het aan de silica en komt je eiwit later dan verwacht uit de kolom
Functie guanidine HCL
guanidine HCL is een stof die zorgt voor ontvouwing van het eiwit. breekt allerlei waterstofbruggen af
Natief scheiden kan alleen bij eiwitten met een Mw van 5.000-700.000 DA (bij SEC-3000). Als je guanidine HCL toevoegt kan dan je ook lichtere eiwitten scheiden (vanaf 1000)
SDS-page
Page –> elektroforese = scheiding obv lading. Als je er spanning op zet, zal alles naar de positieve kant gaan (is negatief geladen door de SDS).
- Die gel zorgt ervoor dat het eiwit weerstand ondervindt
Hoe groter het eiwit is, hoe moeilijker het door die gel loopt (van boven - naar beneden +) –> grote keten bovenin en kleine onderin
Als je groot bent, ben je traag (bij SEC is tegenovergestelde)
je kan dus met SDS bepalen is mijn eiwit nog intact of niet, je ziet 1 bandje of als het kapot is 2
SDS functie
= Negatief geladen –> gaat plakken aan je eiwit, waardoor het een negatieve lading krijgt negatief en negatief stoten elkaar af dus eiwit gaat uit elkaar, zover als het kan ontvouw je je eiwit
Reducing vs. non-reducing
Gereduceerde gel: dat je er een stofje aan toegevoegd hebt, waarbij de zwavelbruggen verbroken worden.
Bestaat je eiwit uit meerdere aminozuurketens en je doet reducing, dan valt het uit elkaar
Als je resultaten gaat vergelijken, zorg dan dat je reducing met reducing vergelijkt, en niet met
non-reducing
betamercaptoethanol/DTT = reducing stof
Waarom moet je bij SDS-page een referentie meenemen
referentie meenemen –> eiwitladder
- verschillende groottes eiwitten zodat je weet hoe groot jouw eiwit is
OOK heb je een standaard van je eigen oplossing nodig. Zo weet je wat het eiwit is en wat de mogelijke aggregaten zijn.
Als je wil weten of je eiwit nog intact is doe je ….
non-reducing SDS-page
- Je zou dan, als alles nog aan elkaar zit, 1 band moeten zien
Heavy chain = … DA
Light chain = ….. DA
heavy chain = 50 kDA
Light chain = 23 kDA
Totaal immunoglobuline = 146 kDA
