DNA recombinante Flashcards
DNA recombinante
Secuencias de DNA derivadas de más de una fuente
Enzimas de restricción
- Provienen de bacterias (mecanismo de defensa ante ADN foráneo → lo degradan)
- Función de endonucleasas
- Cortan enlaces fosfodiéster
LAMDA
Bacteriofago con DNA → Lo inyecta a bacteria → replicación, transcripción y traducción
Nomenclatura de las enzimas de restricción
- Acronimo de 3 letras cursivas → 1.- género, 2.- y 3.- especie
- Letra o número de acuerdo a **cepa o serotipo **
- Número romano (cronología en la que se aislaron)
Endonucleasa
- Degrada DNA extraño
- Reconoce una secuencia y corta
Enzimas del sistema de modificación
Metilasas → no degradación (en C o A).
Componentes de las enzimas de restricción
- Endonucleasas
- Enzimas del sistema de modificación
Endonucleasas de restricción I
Corte aleatorio y asimétrico lejos del sitio de reconocimiento
Endunucleasas de restricción II
Secuencias palindrómicas
Corte → Sitio de reconocimiento = sitio de corte
Endonucleasas de restricción tipo III
Corte asimétrico lejos del sitio de reconocimiento
Endonucleasas de restricción tipo IV
Reconoce DNA metilado
Corte cohesivo
Corte en diferente posición
Nucleotidos libres
Endonucleasa de restricción tipo II
Corte romo
Corte simétrico en ambas cadenas
Pasos para generar un DNA recombinante
1.- 2 DNA de distintas fuentes + enzima de restricción
2. Fragmentos complementarios (plasmido)
3. Ligasa
4. DNA recombinate
Vector
Molécula dsDNA con capacidad de albergar un fragmento de DNA exógeno
Vector de clonación
- ORI → TA
- Sitio múltiple de clonación → Enzimas de restricción para insertar DNA complementario
- Marcador de selección → bacteria con plásmido
- Almacena secuencias
- Obtener grandes cantidades de DNA (cél con mismo DNA)
- Plásmidos, bacteriófagos, fagémidos, cósmidos
Vector de expresión
- ORI
- Sitio múltiple de clonación
- Marcador de selección
- Promotor
- IRES
- Sitio de entrada a ribosoma
- Secuencia de poliA
- Producir un transcrito o proteína (info suficiente)
- Plásmidos o bacteriófagos
Plásmido
- dsDNA
- Circulares
- Separados del DNA cromosomico
- Bacterias, levaduras
- ORI
- Gen de resistencia antibiotica
- Región de DNA exógeno
Bacteriófago
- Virus que infecta bacteria
- Elimina genes que no usa para replicación y empaquetamiento
Cósmidos
- Vectores híbridos
- Plásmido ( Gen resistencia + ORI) + Bacteriófago (no proteínas solo empaquetamiento)
Fagémidos
- Plásmido al que se le incorpora el origen de replicacion de un fago.
- No tienen sitios cos → líneal
Cromosomas artificiales
BAC
YAC
Gen cromosómico + gen → se queda gen de replicación
Clonación
- Preparación del inserto que se va a clonar → Enzimas de restricción
- Preparación del vector → Enzima de restricción, Desfosforilacion del vector (eliminacion de los grupos fosfatos), Purificación del plásmido
- Ligación del inserto y el vector → Ligasa
- Preparación de células competentes → Permeabilidad de la membrana para aceptar el vector Glicerol 10% CaCl2
- Transformación celular → Adquisición del gen exógeno Nuevo fenotipo a la célula
- Identificación de las colonias celulares con el vector recombinante
