Análisis de ácidos nucléicos

Question 1

Primer paso para los estudios de biología molecular

Answer 1

Extracción de DNA

Question 2

¿De qué depende el método de extracción?

Answer 2

• Tipo de ácido nucléico
• Organismo de origen
• Fuente de origen
• Técnica a usar

Question 3

Extracción de DNA técnica de fenol-cloroformo

Answer 3

1. Lisis y liberación de DNA
   Cloruro de amonio → lisis de eritrocitos
   SDS → Lisis de membranas celulares y nucleares
2. Extracción de proteínas y lípidos con solventes orgánicos → fenol + cloroformo + alcohol isosalámico → Fase orgánica: lípidos, proteína y debris celulares → Fase acuosa: ácidos nucleicos
3. Precipitación de DNA: solución salina salturada (desnaturaliza proteínas) y etanol 100% (precipita DNA)
4. Lavado del boton de DNA → Etanol 70% (2 veces) + agua
5. Centrifugado
6. Fase fenólica → buffer Tris (EDTA) → abajo

Question 4

¿Por qué es necesario eliminan los eritrocitos durante la extracción de ADN?

Answer 4

Interfieren en el análisis de ADN

Question 5

Compuesto usado para la lisis de membranas y nucleares

Answer 5

Dodecilsulfato sódico
SDS

Question 6

Función de buffer

Answer 6

Liberar DNA de histonas

Question 7

Espectrofotometría

Answer 7

• Solución con moléculas suspendidas permite el paso de luz
• Mayor absorción de luz → Mayor concetración

Question 8

Fluorometria

Answer 8

• Unión específica de colorantes flourescentes ente las dos cadenas del ácido nucléico
• Absorbe luz con una longitud de onda y emite una superior
• Hoechst33258

Question 9

¿En qué se basa la PCR?

Answer 9

En la replicación de una nueva cadena de DNA

Question 10

¿De qué requiere una PCR?

Answer 10

• Secuencia de DNA
• Enzima DNA polimerasa
• Desoxirribunucleotidos
• Primers

Question 11

Pasos para hacer una PCR

Answer 11

• Extracción DNA
• Se coloca en un tubo
• Se agrega → primers, DNA polimerasa, cofactores y nucleotiodos
• Termociclado

Question 12

Por qué se usa la DNA polimerasa

Answer 12

Taq
95º
Polimerisa una cadena de DNA a partir de una preexistente

Question 13

Cofactor de la Taqpolimerasa

Answer 13

Cloruro de magnesio

Question 14

Función de amortiguador

Answer 14

pH aducuado 8.4

Question 15

Función primers

Answer 15

Reconocen secuencias blanco en DNA molde
Transcriben desde 3´
Ricos en GC

Question 16

Fases del termociclado

Answer 16

Desnaturalización → separación de las cadenas, 95º
Hibridación → aliniación primers en 3´, 50º-60º
Extensión → Taq polimerasa actua sobre primers agregando nucleotidos, cadenas complementarias, 72º
40 ciclos

Question 17

Electroforesis

Answer 17

• Separación de moléculas de distinto peso al ser sometidas a un campo eléctrico.
  Elementos
• Camara de electroforesis
• Gel de agarosa → - = poros +
• Transiluminador ultravioleta

Question 18

qPCR

Answer 18

PCR en tiempo real o PCR-TR
* Con cada ciclo se detectan los productos amplificados
* Se usan tinciones o sondas con fluoróforos para detectar fragmentos amplificados
* Cuantificación de la calidad DNA (carga o expresión de genes).

Question 19

Método más sensible para detectar y cuantificar los ácidos nucleicos

Answer 19

qPCR

Question 20

Sonda

Answer 20

Secuencia de nucleoótidos del gen de interes

Question 21

Sistema reportero flourescencia

Answer 21

qPCR
Específico → secuencia complementaria
Sonda flourescente de oligonucleótidos con reportero flourescente
No específico → Se intecala en doble cadena
Moléculas intercalants con afinidad por el dsDNA, genera señal flourescente SYBER Green

Question 22

PCR estándar

Answer 22

Cualitativa → presencia o ausencia

Question 23

PCR múltiple

Answer 23

Detección cualitativa de distintos genes

Question 24

PCR-RFLP

Answer 24

Restrictión fragment lenght polymorphism

Question 25

PCR-RT

Answer 25

ARN → cADNA
Detección de virus