Diagnostics de laboratoire des infections Flashcards
Quelles sont les trois phases du cheminement en microbiologie infectiologie?
- Phase pré-analytique
- Phase analytique (avec survol des cultures)
- Phase post-analytique
Que contient la phase pré-analytique?
- Patient consulte avec symptômes/signes cliniques pouvant suggérer une maladie infectieuse (hypothèses diagnostiques)
- Prescription de prélèvements selon le cas
→examens directs
→Cultures
→Détections antigéniques/PCR (tests biomoléculaires)
→Sérologie - Prélèvements nécessitant la requête du prescripteur et identification double du spécimen pour le patient
→Acheminement au laboratoire
→importance pour les cultures notamment de connaître les germes recherchés de routine et ceux nécessitant une demande spéciale (ex: mycobactériologie/mycologie) - Réception des prélèvements au laboratoire.
Que contient la phase analytique?
- Selon protocole, examen direct sur le prélèvement
- cultures bactériennes courantes
- identification des résultats
- Rapports préliminaires selon les étapes analytiques
Quelles sont les étapes progressives et successives d’une culture bactérienne courante?
- ensemencement/incubation (durée variable selon spécimen et pathogène recherché) ex: urines: 48 à 72 h; recherche de TB : 6 sem
- isolement/épuration (objectif: culture pure)
- lecture périodique (ex: au 24 h pour les pathogènes usuels)
Que recherche-t-on à l’identification des cultures bactériennes courantes?
- Aspects des colonies (grosseur, convexité etc..) *
- Hémolyse sur gélose sang
- Beta → complète
- Alpha → partielle (aspect verdâtre) - Test biochimiques rapides (catalase/oxydase par ex)
- Aspect au gram des colonies
- Staphylocoques: cocci gram + en amas
- Streptocoques: cocci gram + en chaînettes
- Entérobactéries: Bâtonnets gram -
Quelles sont les analyses supplémentaires que l’on peut faire sur une culture bactérienne commune?
- Analyse biochimique de l’isolat → Ex. Vitek→ code numérique
- Malditof (Matrix Assisted Laser Desorption Ionization- Time of Flight)
→ Spectromètre de masse couplant une source d’ionisation laser assistée par une matrice et un analyseur de temps de vol - Antibiogramme
→ limité selon l’espèce et les valeurs de référence - Notion de résultats critiques (nécessitant un rapport sans délai au prescripteur) et non critiques
ex: de résultat critique: examen direct ou culture + sur LCR ou Hémocultures
Que contient la phase post-analytique?
- Émission du rapport final (validé par le microbiologiste infectiologue)
→ 2 notions d’importance dans le processus analytique microbiologique:
- la validité du résultat
- le délai de réalisation analytique ( en particulier pour les analyses extra-muros) - Interprétation finale du médecin prescripteur
→prélèvement d’un site stérile (ex: LCR, synovial, pleural) - le ou les germes identifiés à ces sites doivent faire l’objet d’une lecture attentive du rapport et d’une prise en charge conséquente.
→site non stérile: qui comprend une flore normale (colonisante) (ex: bouche, peau, génital) +/- contaminante
-connaître la flore normale de ces sites pour l’interprétation
-porter attention aux bactéries identifiées qui ne font pas partie de la flore normale ou qui sont reconnues pathogènes
Qu’est-ce que la coloration de Gram?
- inventée par Hans Christian Joachim Gram en 1884
- la plus utilisée pour l’examen microscopique des bactéries
- coloration basée sur la différence des parois entre Gram+ et Gram-
Quelle est la procédure de la coloration de Gram?
- 1e colorant (Crystal violet →bleu ) (≥15 sec)
- Lavage à l’eau/puis Lugol (iode) comme mordant (≥15 sec)
- Acétone/Alcool (décolorant) (≥15 sec)
- Lavage à l’eau
- Contre colorant (Safranine rose/rouge) (≥ 15 sec)
Quelles sont les limites de la sensibilité de la coloration de Gram?
-Densité bactérienne du prélèvement (densité ↑ : sensibilité ↑)
-Résolution optique ex: Treponema (non visible)
-La présence ou non d’une paroi bactérienne ex: Mycoplasma (non visible)
-Type de paroi bactérienne ex: Mycobacterium (non visible- Aspect de fantômes)
Par quoi est-ce que les bactéries habituellement visibles au Gram peuvent être affectées (phénomène de Gram variable)?
- conditions de culture
- exposition préalable aux antibiotiques
- propriété intrinsèque à se décolorer
Quelles sont les utilités de la coloration de Gram?
- Reconnaître rapidement le ou les bactéries possiblement pathogènes ( y compris parfois les éléments fongiques) dans le prélèvement et d’en informer le clinicien
- Évaluer la présence ou l’absence de flore normale quand le prélèvement provient d’un site non stérile
- Évaluer la réponse inflammatoire car les globules blancs sont colorés dans le processus.
- Quantifier de façon relative les polynucléaires vs les cellules mononucléées et aider à distinguer infection bactérienne et infection virale.
Quand est-ce qu’on fait la coloration de Gram au laboratoire?
spécimen reçu :
- De routine, en urgence: ex: liquide céphalo-rachidien
- De routine, non urgente: ex: expectorations
- Sur demande spéciale: ex: prélèvement urinaire
Quand est-ce que la coloration de Gram est fait pour les hémocultures reçues (bouteilles prélevées)?
- Prélèvements incubés; coloration de Gram effectuée uniquement sur les bouteilles ciblées + par l’appareil
- Résultat positif est jugé critique: appel au médecin prescripteur dans tous les cas
- 90 % des bouteilles qui seront positives le seront dans les premières 48 h d’incubation
Qu’est-ce que les colorations d’acido-alcoolo-résistance?
- S’adressent aux bactéries dont la paroi est riche en acides mycoliques (acides gras à longues chaînes) qui sont difficiles à colorer notamment au Gram
- colorations où les bactéries résistent à une décoloration par un alcool acidifié (éthanol/HCL dans le cas du Ziehl ou Kinyoun)
→Bacilles acido-alcoolo-résistants (BAAR)
→Mycobactéries tuberculeuses et non tuberculeuses par exemple
résumé de la procédure d’une coloration d’acido-alcoolo-résistance?
- Lame colorée avec Carbol Fuchsine (rose/rouge)
- Décoloration avec alcool acidifié
- Contre-coloration bleu de méthylène (bleu)
- Résultats + +Bactéries rouges
(bâtonnets) sur fond bleuté
Quelles sont les colorations usuelles et elles servent à chercher quoi?
- Ziehl-Neelson (coloration à chaud)
- Kinyoun (coloration à froid)
–> S’adresse à la recherche des Mycobactéries
- Kinyoun modifié
(emploi d’un décolorant plus doux)
–> S’adresse à la recherche de certaines espèces partiellement acido-alcoolo- résistantes (Nocardia notamment)
Qu’est-ce que l’auramine (rhodamine)?
- Fluorochromes non spécifiques qui se lient aux acides mycoliques et résistent à la décoloration par l’alcool acidifié
- résultat positif: Bactéries (bâtonnets) fluorescentes jaunâtres sur fond noirâtre
- valeur diagnostique équivalente au Zielh-Neelson; lecture plus rapide pour le technicien.
- limites des colorations d’acido-alcoolorésistance lorsqu’effectuées sur les prélèvements reçus pour la tuberculose: sensibilité supérieure (50-60 %) dans les prélèvements respiratoires que ceux extra-pulmonaires (10 à 30%)
Qu’est-ce que l’immunofluorescence?
- Ac combinés à un marqueur fluorescent qui se lient à un antigène spécifique
- Observation au microscope à fluorescence
ex: Légionnaire (Légionella) - Résultat positif: Bactéries vert pomme granulaire sur fond noirâtre
- De plus en plus remplacée par d’autres méthodes immunologiques (ex: EIA - technique immuno- enzymatique) et les PCR (techniques biomoléculaires)
Qu’est-ce que le KOH?
Utilisation du KOH 10% directement sur des spécimens cliniques (ongles, peau, cheveux) pour digérer la kératine et rendre plus visibles les éléments fongiques mycéliens
Qu’est-ce que le fond noir?
- Utilisation de la diffraction de la lumière pour mettre en évidence les tréponèmes (syphilis) (spirochètes)(non visibles au Gram)
- Examen direct au microscope ayant condensateur dédié pour des prélèvements obtenus de chancres notamment (ulcères)
- Résultat positif: Bactéries brillantes sur fond noir, mobiles
- Tombe en désuétude: faible demande; expertise technique; meilleurs tests sérologiques disponibles
Qu’est-ce que le calcufluor?
- Azurant optique (blanchiment) qui se lie à la cellulose et la chitine, fluorescent à une longueur d’onde dédiée aux UV (microscope à fluorescence)
- Utilisée dans la détection principalement:
- des champignons, incluant Pneumocystis jirovecii
- les amibes pathogènes (ex : Naegleria/Acanthamoeba)
- Parfois utilisé concomitamment avec KOH
- Résultat positif: Éléments fongiques blanc bleutés à verdâtres fluorescents sur fond noirâtre
- Coloration non spécifique; risque de faux positifs avec éléments tissulaires (collagène) ou de l’environnement (ex: fibres de coton)
Qu’est-ce que les tests de détection rapide d’antigènes?
- Diverses méthodes existent sur une base commerciale pour détecter rapidement la présence d’antigènes (souvent des protéines de surface) caractéristiques de certains micro- organismes
ex:
- Détection rapide des Streptocoques béta-hémolytiques (gr A ou pyogenes) dans les gorges
- Détection de Cryptococcus neoformans (levure pathogène) dans le sang ou les LCR - Utilisation d’amorces et Amplification d’une partie du génome de l’agent microbien à identifier (générer des multiples copies)
- Détection de la portion du génome amplifié
- Secteur diagnostique en constant développement:
- sensibilité et spécificité usuellement élevés
- rapidité/automatisation
- monoplex /multiplex
ex: PCR VHS (Herpès simplex); PCR COVID-19 - Limitations: coûts et accessibilité (appareils)
Qu’est-ce que la sérologie?
- Mettre en évidence des preuves indirectes de la présence d’un agent infectieux
- Détection Ac spécifiques contre un agent infectieux, usuellement dans le sérum (sérologie)
- Utilité la plus fréquente dans les infections virales et parasitaires ex: Hépatites (A,B,C), VIH, Rubéole, Toxoplasmose, EBV, CMV
- Utilité dans le Dx d’infection aigüe ou le dépistage d’immunité
Quel est le dosage effectué pour la sérologie?
IgM:
- apparition en phase aigüe de la maladie
- spécificité parfois moindre que l’igG
- nécessite 1 seul sérum pour le diagnostic
- utile au diagnostic de l’infection aigüe si la technique est performante pour le germe recherché
IgG:
- apparition en phase de convalescence de la maladie
- spécificité élevée
- nécessite 2 sérums pour le diagnostic
- notion de séroconversion:
*2 sérums analysés à 2 ou 3 semaines d’intervalle montrent un titre qui passe de négatif à positif
*ou le titre augmente significativement de 4 dilutions et plus:
ex: de 1⁄4 à 1/16 ou plus
- Notion d’anticorps igG neutralisants ou non :
*neutralisants: signe une immunité à long terme
ex : igG VHA (Hépatite A)
*non neutralisants: signe une exposition sans immunité
ex : igG VHC (Hépatite C)
Résumé du cours
- Le cheminement diagnostique en infectiologie comprend 3 phases : pré-analytique, analytique et post-analytique.
- Les examens directs au laboratoire permettent d’évaluer la réponse de l’hôte à l’infection, soumis et peuvent identifier présumé de l’infection
- En plus des cultures microbiologiques traditionnelles, le laboratoire de microbiologie offre et des épreuves
sérologiques des infections chez l’humain.
