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MMD1045 > Diagnostic moléculaire > Flashcards

Diagnostic moléculaire Flashcards

1
Q

Définir le diagnostic moléculaire

A

Diagnostic des pathologies causées par des variations pathologiques d’un gène, de plusieurs gènes ou de l’épigénome

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Q

Quels sont les deux types de variabilité du génome ?

A
  • Variabilité non-pathologique : divergence de la séquence d’ADN n’étant pas associée à une pathologie génétique
  • Variabilité pathologique : changement permanent et transmissible de la séquence d’ADN causant un phénotype pathologique
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Q

Vrai ou faux ? Il existe peu de tests diagnostiques disponibles en génétique

A

Faux, il en existe plus de 60 000 et près de 10 nouveaux tests sont disponibles chaque jour

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4
Q

Combien de liens H y a-t-il entre C et G ? Entre A et T ?

A
  • C-G : 3 liens hydrogène
  • A-T : 2 liens hydrogène
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Q

Pourquoi la plupart des variations génétiques n’ont pas d’impact phénotypique ?

A
  • Surviennent dans des régions non-codantes sans affecter l’expression du gène
  • Polymorphismes fréquents (SNPs)
  • Touchent un gène récessif sans qu’il n’y ait une seconde variation dans le gène
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6
Q

Nommer des causes externes de variation génétique

A
  • Radiation
  • UV
  • Chimique (ex. agents alkylants)
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7
Q

Nommer des causes internes de variation génétique

A
  • Dépurination
  • Déamination
  • Radicaux libres
  • Erreurs de la polymérase
  • Erreurs de réplication/recombinaison
  • Méthylation
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8
Q

Pourquoi les ilôts CpG sont-ils des endroits de prédilection pour les mutations ? Décrire le mécanisme

A
  • C devient méthyl-C
  • Méthyl-C devient U
  • U devient T

Donc, CG devient TG (20x plus fréquent que les autres mutations)

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9
Q

Distinguer les types de variations non-pathologiques du génome selon leurs tailles

A
  • Grandes : CNV, LINE
  • Moyennes : microsatellites
  • Petites : SNP, indels
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10
Q

Distinguer les types de variations pathologiques du génome selon leurs tailles

A

Grands réarrangements
- Insertions
- Délétions
- Équilibrés

Petits réarrangements
- Délétions
- Insertions (mutations dynamiques)
- Substitutions (transitions, transversions)

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11
Q

Quel type de mutation pathologique est le plus fréquent ?

A

Substitution

ensuite, petites délétions et épissage

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12
Q

Nommer les 4 conséquences possibles des variations dans la séquence d’ADN

A
  • Homologue (silencieux) : change un codon pour un autre qui code pour le même acide aminé
  • Faux-sens (missense) : change un codon pour un autre qui code pour un acide aminé différent
  • Non-sens (nonsense) : change le codon pour un codon stop
  • Altération du cadre de lecture (frameshift) : insertion/délétion qui n’est pas un multiple de 3 = modification du codon et de ceux en aval
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13
Q

Vrai ou faux ? Les mutations non-sens et frameshift sont habituellement pathologiques

A

Vrai
- Les mutations homonymes sont habituellement bénignes
- Les faux-sens sont variables

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14
Q

Nommer les 5 éléments à considérer pour la pathogénicité d’une mutation

A
  • Fréquence dans la population
  • Conservation (dans la nature)
  • Impact sur l’ARNm
  • Impact sur la protéine
  • Fonction du gène
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15
Q

Distinguer gène dominant VS récessif

A
  • Dominant : phénotype exprimé à l’état hétérozygote
  • Récessif : phénotype exprimé à l’état homozygote seulement
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16
Q

Distinguer perte et gain de fonction via une mutation

A
  • Perte de fonction : réduction dans la quantité ou l’activité de la protéine entraîne le phénotype
  • Gain de fonction : augmentation dans la quantité ou l’activité de la protéine ou l’acquisition d’une nouvelle fonction entraîne le phénotype
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17
Q

Nommer les 5 mécanismes associés aux gains de fonction

A
  • Augmentation du dosage génique
  • Altération de l’expression de l’ARNm
  • Activité accrue de la protéine
  • Nouvelle fonction de la protéine
  • Altérations toxiques de la protéine
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18
Q

Vrai ou faux ? On utilise un échantillon de sang pour isoler l’ADN via les globules rouges?

A

Faux, les seules cellules nucléées du sang sont les leucocytes, c’est donc eux qu’on utilise pour isoler l’ADN

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19
Q

Décrire la technique des sels chaotropiques pour l’isolation de l’ADN ; quels sont ses avantages ?

A

ADN adsorbe sur une colonne de verre/membrane
- Non-toxique et automatisable

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20
Q

Quels sont les deux manières d’évaluer l’efficacité de l’isolation de l’ADN?

A
  • Densité optique : estimation de la quantité de l’ADN, sachant que ratio 260/280 estime la pureté (260 = absorbance max ADN, 280=absorbance max protéines)
  • Teintures intercalantes : composés qui se fixent à l’ADN double brin, permet d’estimer la quantité et la taille de l’ADN
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21
Q

En quoi consiste l’électrophorèse capillaire ?

A

Séparation des molécules d’ADN selon leur taille en les faisant migrer à travers un gel (ex. agarose)

22
Q

Nommer un exemple de techniques de base de diagnostic moléculaire sur l’ADN génomique

A

Buvardage Southern (Southern Blot)

23
Q

Nommer des exemples de techniques de base de diagnostic moléculaire sur produits de PCR

A
  • PCR-migration
  • PCR-digestion
  • PCR-séquençage
  • PCR en temps réel
  • Allèle-specific oligonucleotides
  • ASPE
  • MLPA
24
Q

En quoi consiste le buvardage Southern ?

A

Technique qui combine l’électrophorèse sur gel de l’ADN génomique fragmenté à l’hybridation par sonde complémentaire à l’ADN cible

25
Q

Quels sont les étapes du buvardage Southern?

A
  • Digestion de l’ADN génomique
  • Électrophorèse capillaire
  • Transfert sur membrane
  • Hybridation
  • Détection par autoradiographie
26
Q

Vrai ou faux ? Le buvardage Southern permet de quantifier les grandes expansions (mutations dynamiques)?

A

Vrai

27
Q

Quelles sont les différentes composantes de la réaction PCR?

A
  • ADN du patient
  • Amorces
  • Polymérase
  • Nucléotides
  • Tampon (Mg, ions)
  • Autres additifs (si nécessaire)
28
Q

Est-ce que la PCR est fiable à 100% ?

A

Non, il existe toujours un petit risque que la polymérase Taq fasse une erreur et ajoute donc un artéfact

29
Q

Quelle formule permet de calculer le nombre de molécules d’ADN produites à chaque cycle de PCR ?

A

Nombre de molécules d’ADN : 2^n, où n = nombre de cycles PCR

La quantité d’ADN double à chaque cycle

30
Q

Qu’est-ce que la PCR-migration?

A
  • Permet de détecter des insertions ou délétions
  • Électrophorèse capillaire des produits de PCR et détection du signal : la distance de la bande reflète sa taille
31
Q

Quels sont des applications de la PCR-migration?

A
  • Analyses d’identité génétique (judiciaire, contamination foeto-maternelle..)
  • Insertions et délétions récurrentes
32
Q

Comment parvient-on à savoir s’il y a eu ou non contamination foeto-maternelle?

A

Via PCR-migration, on regarde sur l’ADN foetal si les deux allèles maternels sont présents : normalement, on devrait seulement avoir un allèle identique (l’autre vient du père)

33
Q

Qu’est-ce que la PCR-digestion?

A

Digestion d’un produit de PCR par une enzyme de restriction qui reconnaît une séquence spécifique : la mutation crée ou abolit le site de restriction

34
Q

Quels sont des applications de la PCR-digestion?

A

Mutations ponctuelles récurrentes
- On doit d’abord connaître la mutation recherchée avant le test pour trouver un site de restriction crée/aboli par la mutation pour valider sa présence

Ex. on va voir une bande à 150bp et une autre à 300pb au lieu d’en voir une seule plus foncée à 150pb

35
Q

Qu’est-ce que la technique d’ASPE (Allele Specific Primer Extension)?

A

Amplification PCR, puis jeu d’amorces marquées par fluorescence dont certaines ont un mismatch 3’

36
Q

Comment procède-t-on au séquençage Sanger ?

A
  • Amplification PCR
  • Dénaturation
  • Réamplification avec mélange de nucléotides et nucléotides modifiés, marqués par fluorescence (incorporation aléatoire)
37
Q

Distinguer les dNTPs et les ddNTPs

A

Les ddNTPs n’ont pas de -OH sur le carbone 3’ du ribose, ce qui empêche la liaison du prochaine dNTP (chain termination)

38
Q

Quels sont des applications du séquençage Sanger?

A
  • Gènes avec grand nombre de mutations dispersées à-travers du gène
  • Méthode de choix pour substitutions
  • Bonne méthode pour petites insertions ou délétions

Ne permet pas de détecter les grandes anomalies de dosage

39
Q

Qu’est-ce que la technique de PCR temps-réel?

A

Réaction de PCR avec détection du produit simultanée, permet discrimination allélique et quantification (relative/absolue)

40
Q

Comment interprète-t-on le PCR temps-réel pour la discrimination allélique?

A

amorce marquée avec sonde marquée
- quand amorce est libérer la sonde fait une fluorescence spéficique sur l’allèle

41
Q

Comment interprète-t-on le PCR temps-réel quantitatif ?

A

On fixe un seuil arbitraire, et selon le nombre de cycles auxquel on atteint le seuil, on peut trouver la quantité d’ADN de départ

42
Q

Qu’est-ce que la technique de MLPA (Multiplex Ligation Probe Amplification)?

A

Méthode pour la recherche de délétions/duplications, sonde en deux sous-unités qui doivent s’hybrider côte-à-côte sur l’ADN du patient. La ligase scelle ensuite les 2 sous-unités, puis amplification PCR et électrophorèse capillaire

43
Q

À quoi sert le séquençage de nouvelle génération (SNG) ?

A
  • Permet de multiplier l’information obtenue d’une analyse
  • Permet d’anlyser plusieurs gènes, voire plusieurs patients en même temps grâce aux codes-barre moléculaires
44
Q

Comment se fait la fragmentation de l’ADN dans le séquençage de nouvelle génération?

A
  • Sonication
  • Nébulisation
  • Digestion
45
Q

Qu’est-ce qu’un code-barre moléculaire ?

A

Séquence d’une quinzaine de nucléotides aléatoires qu’on lie à l’ADN d’un patient et qui permet donc de l’identifier par la suite

46
Q

Quels sont les étapes du séquençage nouvelle génération?

A
  • Fragmentation de l’ADN
  • Liaison d’adapteurs (code-barre moléculaire)
  • Capture
  • Amplification en parallèle
  • Séquençage en parallèle
47
Q

Quels sont les deux techniques d’amplification en parallèle?

A
  • PCR-émulsion : comme eau et huile, l’émulsion fait que les ADNs se séparent dans les différentes micelles
  • PCR-cluster : utilisation d’une plaque avec adaptateur de séquençage
48
Q

Quel est le rôle de l’analyse bioinformatique dans le séquençage nouvelle génération?

A
  • Procèder à l’alignement des séquences de 100/150 paires de bases générées (plusieurs milliers)
  • Identifier si des variations de ces séquences sont présentes
  • Déterminer si certaines de ces variations sont pathologiques et situées dans des gènes qui pourraient expliquer le phénotype du patient
49
Q

Nommer deux exemples d’application du séquençage de nouvelle génération

A
  • Exome
  • ADN foetal circulant (produit par l’unité placentaire, circule dans plasma de la femme enceinte)
50
Q

Qu’est-ce qu’un exome?

A

C’est le 1% du génome qui contient les exons (régions codantes)

51
Q

Vrai ou faux ? La fréquence des variations génétiques est plutôt faible dans la population?

A

Faux
- Chaque individu à 5-6 millions de variations génétiques, dont environ 70 sont de novo
- Toutefois, la plupart de ces variations n’ont pas d’impact phénotypique

MMD1045 (20 decks)

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