Cours 9 : Analyse de l'ARN Flashcards
Vrai ou faux. Dans tous les organismes, l’ARNm est très instable.
Faux. Chez les eucaryotes, l’ARNm est stable. Par contre, chez les procaryotes, l’ARNm est instable et possède une courte demi-vie.
Nommez les modifications post-transcriptionnelles de l’ARNm chez les procaryotes et les eucaryotes.
Procaryotes : aucune
Eucaryotes : Coiffe 5’, Queue polyA 3’, épissage : introns/exons
Comment se nomme l’enzyme qui dégrade l’ARN?
RNase
Quelles précautions peut-on prendre pour ne pas contaminer l’ARN?
- Matériels RNase-free (Plastique jetable, verrerie à 180° pendant 8h, traitement au DEPC, RNase away)
- Espace réservé
- Gants
Quelle proportion de l’ARN total contient de l’ARNm?
1-5%
Expliquez le principe d’isolation des ARNm, polyA+
Ce principe s’applique aux eucaryotes, qui ont des ARNm possédant des queues polyA en 3’. On peut donc mettre sur des billes, résines ou colonnes une queue poly-T, pour purifier les ARNm et les éluer par la suite.
Nommez les 5 étapes d’une hybridation de type nothern avec de l’ARN
1) Extraction d’ARN
2) Electrophorèse (10ug)
3) Transfert sur membrane
4) Hybridation (Sonde)
5) Révélation
Quelles sont les étapes d’une protection à la RNase et le but de la procédure?
Le but est de détecter un ARNm spécifique.
1) Hybridation + sonde.
2) Protection : Digestion à la RNase (Si hybridation= protection)
3) Électrophorèse et détection
Quel est l’outil le plus puissant, sensible et quantitatif pour la détection du niveau d’ARN?
q-RT-PCR
Lors de l’isolation de l’ARN total, on effectue une centrifugation pour séparer la phase aqueuse de la phase organique. Dans quelle phase se retrouve l’ARN?
Dans la phase aqueuse.
Quel ratio A260/A280 va-t-on obtenir en faisant une extraction d’ARN total? (si elle a fonctionné)
2.0
Nommez les 6 utilisation de l’ARN.
1) ARNm (Sélection de polyA+)
2) Protection à la RNAse
3) Hybridation de type Northern
4) RT-PCR
5) Extension d’amorce : primer extension
6) Transcriptome RNA-seq
Quelles sont les application de l’hybridation de type nothern?
Détection : Révéler la présence de molécules d’ARN spécifiques, localiser l’ADN ou sa distribution, détecter les différentes formes d’épissage des ARN
Quantification: Déterminer l’abondance, mesurer l’expression, comparer l’expression
Quel est le but de la protection à la RNase?
Détecter un ARNm
Qu’est ce qu’on peut avoir comme information sur l’ARN après la RT-PCR?
- Détection d’un gène à partir de peu de molécules d’ARN
- Expression absolue (courbe standard) ou relative (ratio vs contrôle interne); qualitatif et quantitatif
Qu’est ce qu’on a besoin pour faire une RT-PCR en 1 étape?
Tous les réactifs pour la RT et la PCR
1) Amorces spécifiques + RT + ADN polymérase +autres
Qu’est ce qu’on a besoin pour faire une RT-PCR en 2 étapes?
1) RT : Amorces aléatoires + RT + autres = cDNA
2) PCR : Amorces spécifiques + ADN polymérases + autres
Quel est le but de la q-RT-PCR?
Quantification d’un ARN dans un échantillon (nombre de copies).
Nommez 4 applications de la RT.
1) Biologie moléculaire
2) Expression de gènes
3) Quantification
4) Diagnostic
Les ARNr et ARNt sont des ARN non codants. Sont-ils régulateurs ou non régulateurs?
Non régulateurs
Les petits ARN ont-ils un impact au niveau de la transcription ou de la traduction? Quel est cet impact?
Activation ou inhibition de la traduction.
On dit que les sRNA sont aidés par une autre protéine. Quelle est cette protéine?
Chaperone Hfq
Expliquez comment fonctionne le processus d’interférence par ARN: ARNi.
Le RNAi a une activité de dégradation double brin. Il va se lier au complexe RISC. Ce dernier va scanner l’ARNm, et le dégrade si la séquence du RNAi est reconnue.
Pourquoi utiliserais-ton le RNAi?
Pour prévenir l’expression de gènes (gene silencing) : Analyse de la fonction d’un gène, outil de recherche, analyse de la voie métabolique, redondance, thérapie…
Que veut dire Cas?
Crispr associated genes
Où peut-on insérer de nouvelles séquences spacer dans le système CRISPR-Cas?
Dans la région leader
De quoi sont dérivées les séquences uniques dans le génome bactérien?
De génomes viraux.
Expliquez le mécanisme de CRISPR
- Les CRISPR sont transcrits en ARN.
- Ces ARN sont découpés en ARN plus petits, les unités répétées servant de sites de reconnaissance pour la coupure = crRNA
- Certains intervalles (spacers) sont complémentaire d’ADN viraux ou plasmidiques
- En s’hybridant avec leur cible (guide RNA) les crRNA déclenchent la dégradation à l’aide des Cas ou un arrêt de la traduction des ARNm du génome étranger..
- Cette coupure réduit ou annule le pouvoir infectieux des phages ou plasmides.
Nommez les 3 étapes de CRISPR-Cas (expliquez les un petit peu aussi)
- Adaptation (Phage infecte et on prend un peu de son ADN qu’on va insérer dans les séquences CRISPR : PAM)
2-Biogenèse (petits crARN vont être transcrits et contiennent l’ARN étranger : seront associés avec Cas)
3- Interférence (Scan de l’ADN, reconnaissance et clivage)
Vrai ou faux. Il n’existe qu’un seul type de CRISPR.
Faux! Il y en a plusieurs types
Quelles sont les applications de CRISPR-Cas aux bactéries?
- Typage de souches : Évolution
- Vaccination (souches résistante aux phages) Industries alimentaires (lait, fromage, vin)
Qu’est ce que l’ARNguide et son utilité?
C’est une fusion du tracrARN et du crARN (simple) + Cas9.
On peut donc choisir où on veut couper, même dans les cellules de mammifères!
Vrai ou faux. Une coupure double brin est létale chez les bactéries.
Vrai.
En 2016, quelque chose a été élaborer pour contrer le fait que les cassures doubles brin sont létales chez les bactéries et pouvoir faire de l’édition de génome. Qu’est ce que c’est?
On a ajouté une recombinase!
Ainsi, on a Cas9+ gRNA + recombinase + ADN recombinant = édition de génome.
En utilisant CRISPR-Cas9 comme antimicrobien, qu’est ce qu’on cible?
- Un gène (résistance ou virulence)
- Un processus cellulaire
- Une bactérie spécifique = microbiote intact!
