Cours 9 : Analyse de l'ARN Flashcards
Vrai ou faux. Dans tous les organismes, l’ARNm est très instable.
Faux. Chez les eucaryotes, l’ARNm est stable. Par contre, chez les procaryotes, l’ARNm est instable et possède une courte demi-vie.
Nommez les modifications post-transcriptionnelles de l’ARNm chez les procaryotes et les eucaryotes.
Procaryotes : aucune
Eucaryotes : Coiffe 5’, Queue polyA 3’, épissage : introns/exons
Comment se nomme l’enzyme qui dégrade l’ARN?
RNase
Quelles précautions peut-on prendre pour ne pas contaminer l’ARN?
- Matériels RNase-free (Plastique jetable, verrerie à 180° pendant 8h, traitement au DEPC, RNase away)
- Espace réservé
- Gants
Quelle proportion de l’ARN total contient de l’ARNm?
1-5%
Expliquez le principe d’isolation des ARNm, polyA+
Ce principe s’applique aux eucaryotes, qui ont des ARNm possédant des queues polyA en 3’. On peut donc mettre sur des billes, résines ou colonnes une queue poly-T, pour purifier les ARNm et les éluer par la suite.
Nommez les 5 étapes d’une hybridation de type nothern avec de l’ARN
1) Extraction d’ARN
2) Electrophorèse (10ug)
3) Transfert sur membrane
4) Hybridation (Sonde)
5) Révélation
Quelles sont les étapes d’une protection à la RNase et le but de la procédure?
Le but est de détecter un ARNm spécifique.
1) Hybridation + sonde.
2) Protection : Digestion à la RNase (Si hybridation= protection)
3) Électrophorèse et détection
Quel est l’outil le plus puissant, sensible et quantitatif pour la détection du niveau d’ARN?
q-RT-PCR
Lors de l’isolation de l’ARN total, on effectue une centrifugation pour séparer la phase aqueuse de la phase organique. Dans quelle phase se retrouve l’ARN?
Dans la phase aqueuse.
Quel ratio A260/A280 va-t-on obtenir en faisant une extraction d’ARN total? (si elle a fonctionné)
2.0
Nommez les 6 utilisation de l’ARN.
1) ARNm (Sélection de polyA+)
2) Protection à la RNAse
3) Hybridation de type Northern
4) RT-PCR
5) Extension d’amorce : primer extension
6) Transcriptome RNA-seq
Quelles sont les application de l’hybridation de type nothern?
Détection : Révéler la présence de molécules d’ARN spécifiques, localiser l’ADN ou sa distribution, détecter les différentes formes d’épissage des ARN
Quantification: Déterminer l’abondance, mesurer l’expression, comparer l’expression
Quel est le but de la protection à la RNase?
Détecter un ARNm
Qu’est ce qu’on peut avoir comme information sur l’ARN après la RT-PCR?
- Détection d’un gène à partir de peu de molécules d’ARN
- Expression absolue (courbe standard) ou relative (ratio vs contrôle interne); qualitatif et quantitatif
Qu’est ce qu’on a besoin pour faire une RT-PCR en 1 étape?
Tous les réactifs pour la RT et la PCR
1) Amorces spécifiques + RT + ADN polymérase +autres
Qu’est ce qu’on a besoin pour faire une RT-PCR en 2 étapes?
1) RT : Amorces aléatoires + RT + autres = cDNA
2) PCR : Amorces spécifiques + ADN polymérases + autres
Quel est le but de la q-RT-PCR?
Quantification d’un ARN dans un échantillon (nombre de copies).
Nommez 4 applications de la RT.
1) Biologie moléculaire
2) Expression de gènes
3) Quantification
4) Diagnostic
Les ARNr et ARNt sont des ARN non codants. Sont-ils régulateurs ou non régulateurs?
Non régulateurs
Les petits ARN ont-ils un impact au niveau de la transcription ou de la traduction? Quel est cet impact?
Activation ou inhibition de la traduction.
On dit que les sRNA sont aidés par une autre protéine. Quelle est cette protéine?
Chaperone Hfq
Expliquez comment fonctionne le processus d’interférence par ARN: ARNi.
Le RNAi a une activité de dégradation double brin. Il va se lier au complexe RISC. Ce dernier va scanner l’ARNm, et le dégrade si la séquence du RNAi est reconnue.
Pourquoi utiliserais-ton le RNAi?
Pour prévenir l’expression de gènes (gene silencing) : Analyse de la fonction d’un gène, outil de recherche, analyse de la voie métabolique, redondance, thérapie…
