Cours 9 : Analyse de l'ARN

Question 1

Vrai ou faux. Dans tous les organismes, l’ARNm est très instable.

Answer 1

Faux. Chez les eucaryotes, l’ARNm est stable. Par contre, chez les procaryotes, l’ARNm est instable et possède une courte demi-vie.

Question 2

Nommez les modifications post-transcriptionnelles de l’ARNm chez les procaryotes et les eucaryotes.

Answer 2

Procaryotes : aucune

Eucaryotes : Coiffe 5’, Queue polyA 3’, épissage : introns/exons

Question 3

Comment se nomme l’enzyme qui dégrade l’ARN?

Answer 3

RNase

Question 4

Quelles précautions peut-on prendre pour ne pas contaminer l’ARN?

Answer 4

• Matériels RNase-free (Plastique jetable, verrerie à 180° pendant 8h, traitement au DEPC, RNase away)
• Espace réservé
• Gants

Question 5

Quelle proportion de l’ARN total contient de l’ARNm?

Answer 5

1-5%

Question 6

Expliquez le principe d’isolation des ARNm, polyA+

Answer 6

Ce principe s’applique aux eucaryotes, qui ont des ARNm possédant des queues polyA en 3’. On peut donc mettre sur des billes, résines ou colonnes une queue poly-T, pour purifier les ARNm et les éluer par la suite.

Question 7

Nommez les 5 étapes d’une hybridation de type nothern avec de l’ARN

Answer 7

1) Extraction d’ARN
2) Electrophorèse (10ug)
3) Transfert sur membrane
4) Hybridation (Sonde)
5) Révélation

Question 8

Quelles sont les étapes d’une protection à la RNase et le but de la procédure?

Answer 8

Le but est de détecter un ARNm spécifique.

1) Hybridation + sonde.
2) Protection : Digestion à la RNase (Si hybridation= protection)
3) Électrophorèse et détection

Question 9

Quel est l’outil le plus puissant, sensible et quantitatif pour la détection du niveau d’ARN?

Answer 9

q-RT-PCR

Question 10

Lors de l’isolation de l’ARN total, on effectue une centrifugation pour séparer la phase aqueuse de la phase organique. Dans quelle phase se retrouve l’ARN?

Answer 10

Dans la phase aqueuse.

Question 11

Quel ratio A260/A280 va-t-on obtenir en faisant une extraction d’ARN total? (si elle a fonctionné)

Answer 11

2.0

Question 12

Nommez les 6 utilisation de l’ARN.

Answer 12

1) ARNm (Sélection de polyA+)
2) Protection à la RNAse
3) Hybridation de type Northern
4) RT-PCR
5) Extension d’amorce : primer extension
6) Transcriptome RNA-seq

Question 13

Quelles sont les application de l’hybridation de type nothern?

Answer 13

Détection : Révéler la présence de molécules d’ARN spécifiques, localiser l’ADN ou sa distribution, détecter les différentes formes d’épissage des ARN

Quantification: Déterminer l’abondance, mesurer l’expression, comparer l’expression

Question 14

Quel est le but de la protection à la RNase?

Answer 14

Détecter un ARNm

Question 15

Qu’est ce qu’on peut avoir comme information sur l’ARN après la RT-PCR?

Answer 15

• Détection d’un gène à partir de peu de molécules d’ARN

- Expression absolue (courbe standard) ou relative (ratio vs contrôle interne); qualitatif et quantitatif

Question 16

Qu’est ce qu’on a besoin pour faire une RT-PCR en 1 étape?

Answer 16

Tous les réactifs pour la RT et la PCR

1) Amorces spécifiques + RT + ADN polymérase +autres

Question 17

Qu’est ce qu’on a besoin pour faire une RT-PCR en 2 étapes?

Answer 17

1) RT : Amorces aléatoires + RT + autres = cDNA

2) PCR : Amorces spécifiques + ADN polymérases + autres

Question 18

Quel est le but de la q-RT-PCR?

Answer 18

Quantification d’un ARN dans un échantillon (nombre de copies).

Question 19

Nommez 4 applications de la RT.

Answer 19

1) Biologie moléculaire
2) Expression de gènes
3) Quantification
4) Diagnostic

Question 20

Les ARNr et ARNt sont des ARN non codants. Sont-ils régulateurs ou non régulateurs?

Answer 20

Non régulateurs

Question 21

Les petits ARN ont-ils un impact au niveau de la transcription ou de la traduction? Quel est cet impact?

Answer 21

Activation ou inhibition de la traduction.

Question 22

On dit que les sRNA sont aidés par une autre protéine. Quelle est cette protéine?

Answer 22

Chaperone Hfq

Question 23

Expliquez comment fonctionne le processus d’interférence par ARN: ARNi.

Answer 23

Le RNAi a une activité de dégradation double brin. Il va se lier au complexe RISC. Ce dernier va scanner l’ARNm, et le dégrade si la séquence du RNAi est reconnue.

Question 24

Pourquoi utiliserais-ton le RNAi?

Answer 24

Pour prévenir l’expression de gènes (gene silencing) : Analyse de la fonction d’un gène, outil de recherche, analyse de la voie métabolique, redondance, thérapie…

Question 25

Que veut dire Cas?

Answer 25

Crispr associated genes

Question 26

Où peut-on insérer de nouvelles séquences spacer dans le système CRISPR-Cas?

Answer 26

Dans la région leader

Question 27

De quoi sont dérivées les séquences uniques dans le génome bactérien?

Answer 27

De génomes viraux.

Question 28

Expliquez le mécanisme de CRISPR

Answer 28

1. Les CRISPR sont transcrits en ARN.
2. Ces ARN sont découpés en ARN plus petits, les unités répétées servant de sites de reconnaissance pour la coupure = crRNA
3. Certains intervalles (spacers) sont complémentaire d’ADN viraux ou plasmidiques
4. En s’hybridant avec leur cible (guide RNA) les crRNA déclenchent la dégradation à l’aide des Cas ou un arrêt de la traduction des ARNm du génome étranger..
5. Cette coupure réduit ou annule le pouvoir infectieux des phages ou plasmides.

Question 29

Nommez les 3 étapes de CRISPR-Cas (expliquez les un petit peu aussi)

Answer 29

1. Adaptation (Phage infecte et on prend un peu de son ADN qu’on va insérer dans les séquences CRISPR : PAM)
   2-Biogenèse (petits crARN vont être transcrits et contiennent l’ARN étranger : seront associés avec Cas)
   3- Interférence (Scan de l’ADN, reconnaissance et clivage)

Question 30

Vrai ou faux. Il n’existe qu’un seul type de CRISPR.

Answer 30

Faux! Il y en a plusieurs types

Question 31

Quelles sont les applications de CRISPR-Cas aux bactéries?

Answer 31

• Typage de souches : Évolution

- Vaccination (souches résistante aux phages) Industries alimentaires (lait, fromage, vin)

Question 32

Qu’est ce que l’ARNguide et son utilité?

Answer 32

C’est une fusion du tracrARN et du crARN (simple) + Cas9.

On peut donc choisir où on veut couper, même dans les cellules de mammifères!

Question 33

Vrai ou faux. Une coupure double brin est létale chez les bactéries.

Answer 33

Vrai.

Question 34

En 2016, quelque chose a été élaborer pour contrer le fait que les cassures doubles brin sont létales chez les bactéries et pouvoir faire de l’édition de génome. Qu’est ce que c’est?

Answer 34

On a ajouté une recombinase!

Ainsi, on a Cas9+ gRNA + recombinase + ADN recombinant = édition de génome.

Question 35

En utilisant CRISPR-Cas9 comme antimicrobien, qu’est ce qu’on cible?

Answer 35

• Un gène (résistance ou virulence)
• Un processus cellulaire
• Une bactérie spécifique = microbiote intact!