Cours 8- Stratégies de clonage et applications Flashcards
Parmi les clonages à bouts francs ou bouts cohésifs, lequel est le plus efficace?
Clonage à bouts cohésifs.
Combien d’enzymes de restriction sont utilisés pour effectuer un clonage à bouts cohésifs non-directionnel?
1
Quel est l’avantage fonctionnel du clonage directionnel?
L’obtention de l’insert dans le sens désiré permet l’expression appropriée de la séquence clonée qui est dans la bonne orientation par rapport au promoteur.
Un clonage directionnel subit-il une digestion simple ou des digestions doubles?
Digestions doubles.
Qu’est ce qu’une digestion double?
Digestion d’ADN par deux enzymes de restriction distinctes en une seule étape et dans les même conditions réactionnelles.
Qu’arrive-t-il si les conditions réactionnelles ne sont pas adaptées pour les deux enzymes lors de digestions double?
1) Mauvaise efficacité de la digestion
2) Activité étoile
Si l’activité de deux enzymes de restriction sont optimales dans des conditions de rx trop différentes , quelle méthode peut-on employer pour quand même cliver avec 2 enzymes de restriction?
On peut utiliser la méthode de digestions simples séquentielles.
Est-ce possible de conceptualiser un clonage directionnel avec 2 enzymes de restriction différentes qui génèrent des bouts francs?
Non, car ce qui permet un clonage directionnel est les extrémités cohésives. Sans bouts sb, on ne peut pas forcer de direction.
Est-ce possible de conceptualiser un clonage directionnel avec 1 enzyme de restriction qui génère des bouts francs et un qui génère des bouts cohésifs?
Oui. À ce moment là, on force la direction avec le site cohésif. Les deux bouts francs sont liés ensemble, et les deux bouts cohésifs aussi.
Est-il possible de se retrouver en situation de clonage non-directionnel avec des bouts cohésifs provenant de 2 enzymes de restriction différentes?
Oui, si le site de reconnaissance pour les deux enzymes est le même.
Est-ce qu’il y a une étape entre la digestion et la ligation? Si oui, quelle est-elle et comment s’effectue cette étape?
Oui, l’inactivation des enzymes de restriction à la chaleur ou la purification de l’ADN digéré.
Quelle est l’activité enzymatique de l’enzyme ADN ligase T4?
Elle lie de manière covalente l’extrémité 5’-P et 3’OH des séquences d’ADN qui sont à proximité l’une de l’autre.
Est-ce que l’enzyme ADN ligase T4 a besoin d’un apport énergétique?
Oui. Il le reçoit par l’hydrolyse de l’ATP en ADP et Pi.
Comment peut-on inactiver l’enzyme ADN ligase T4?
Par la chaleur.
À quelle température est ce que l’enzyme ADN ligase T4 aura une activité maximale?
16°C
Quelle est l’étape la moins efficace du clonage moléculaire?
La ligation.
Pour réussir un clonage moléculaire, quel est le ratio molaire idéal?
Ratio molaire insert: vecteur de 3:1
Vrai ou faux. Un ratio molaire est exprimé en terme du poids moléculaire.
Faux. En terme du nombre de molécules.