Cours 12: Protéomique 2

Question 1

Qu’est ce qu’une bio-interaction?

Answer 1

C’est une interaction protéine-protéine ou protéine-acide nucléique.

Question 2

Pourquoi étudier les bio-interactions?

Answer 2

Pour mesurer la régulation, les réseaux d’interaction (interactome), les complexes biologiques..

Question 3

Nommez 4 techniques in vivo pour mesurer les interactions protéines-protéines?

Answer 3

1) 2 hybride
2) Liaisons croisées (crosslinking ) TAP
3) Transfert d’électrons (FRET)
4) Phage display

Question 4

Nommez 5 techniques in vitro pour mesurer les interactions protéine-protéine.

Answer 4

1) Immunoprécipitation/pulldown
2) Co-purification
3) Far-Western Blot
4) Liaisons croisées (crosslinking) TAP
5) Transfert d’électrons (FRET)

Question 5

Expliquez le principe et la méthode de la méthode 2 hybrides.

Answer 5

C’est basé sur les propriétés de l’activateur transcriptionnel GAL4 chez les levures. Ils ont un domaine activateur et un domaine de liaison à l’ADN. Si les deux domaines sont proches, il va y avoir transcription.
Ainsi, on peut fusionner ces deux domaines à deux protéines pour voir s’ils vont interagir.

Question 6

Nommez les avantages et les désavantages de la méthode 2 hybrides.

Answer 6

Avantages :

• Peut se faire à l’intérieur de la cellule
• Coût des réactifs
• Le signal est quantifiable

Désavantages :

• Faux négatifs et faux positif
• Clonage nécessaire pour fusionner les protéines
• Les réactions se font dans les levures : glycosylation.

Question 7

Vrai ou faux. Les crosslinker agissent seulement à l’intérieur des cellules.

Answer 7

Faux. Ils peuvent aussi agir au niveau des surfaces

Question 8

Expliquez le principe général des liaisons croisées.

Answer 8

Certains produits chimiques peuvent réagir avec les extrémités N ou C terminales des protéines. Ces produits contiennent deux régions réactifs, qui sont séparés par des distances variables. Si les deux protéines sont proches, on devrait être capable de les lier ensemble.

Question 9

Avec quoi est-ce qu’on peut cliver les liaisons croisées?

Answer 9

Avec des agents réducteurs comme le DTT.

Question 10

Expliquez globalement le principe du phage display.

Answer 10

On détecte des interactions protéine-protéine en utilisant la capside du phage M13. On y fusionne une librairie aléatoire de peptides comme protéines de fusion. La protéine à l’étude est fusionnée sur une plaque 96 puits.
On provoque la liaison des phages, on lave, et on élue. On fait ça 3x, suivi par le séquençage de l’ADN isolé des phages!

Question 11

Vrai ou faux. La technique FRET peut seulement être utilisée in vivo.

Answer 11

Faux! Elle peut aussi être utilisée in vitro (lecture dans un spectromètre de fluorescence) ou in situ (microscope à fluorescence)

Question 12

Expliquez le principe général de la technique pull-down.

Answer 12

La théorie derrière ce principe : Si deux protéines réagissent ensemble, et si on purifie une de ces deux protéines, l’autre suivra!

On peut donc introduire un TAG par clonage à une des deux protéine, procéder à une purification, et visualiser les deux protéines sur un gel SDS-PAGE.

Question 13

D’où proviennent les protéines utilisées lors du pull-down?

Answer 13

D’expression in vivo ou in vitro, ou déjà purifiées.

Question 14

Expliquez le principe du far western blotting.

Answer 14

Sert à détecter des interaction entre deux protéines sur une membrane. On peut transférer des protéines sur une membrane, comme le western blot, et on incube avec une deuxième protéine marquée par radioactivité, fluorescence, ou un autre tag.

Question 15

En ce qui concerne les interactions protéines-ADN, nommez les différentes méthodes in vivo pour les analyser.

Answer 15

1- One hybrid/fusion aux promoteurs

2- Immunoprécipitation du chromatin (ChiP)

Question 16

En ce qui concerne les interactions protéines-ADN, nommez les différentes méthodes in vitro pour les analyser.

Answer 16

1- Liaison aux filtres
2- Chromatographie à l'affinité à ADN
3- Southwestern blot
4- Retard sur gel (EMSA)
5- Empreinte sur l'ADN (footprinting)

Question 17

Quel est le but de la technique one hybrid?

Answer 17

Trouver les protéines capables de lier une séquence cible sur l’ADN.

On doit cloner la séquence de liaison à côté d’un gène rapporteur, puis introduire une librairie de clones exprimant des protéines. Si la protéine se lie à la séquence cible, on a la transcription du gène marqueur.

Question 18

Expliquez le principe général de la liaison aux filtres pour les bio-interactions protéines-ADN.

Answer 18

Les protéines s’attachent aux filtres de nitrocellulose, alors que l’ADN marqué traverse le filtre, sauf s’il est lié par une protéine.

Question 19

Est-ce que la réaction de liaison aux filtres est quantifiable? Si oui comment.

Answer 19

Oui, par décompte de radioactivité.

Question 20

Vrai ou faux. Grâce à la technique de liaison aux filtres, on peut détecter la coopérativité ou la formation d’autres complexes.

Answer 20

Faux.

Question 21

Quel est le principe du southwestern blot?

Answer 21

Le domaine de liaison à l’ADN peut renaturer sur une membrane de nitrocellulose pour permettre une liaison d’un ADN spécifique marqué. C’est donc une combinaison d’un Western blot (protéines fixées à la membrane) avec une sonde d’ADN marquée.

Question 22

Comment peut-on mesurer le centre de la liaison?

Answer 22

En mélangeant des fragments de taille identique, mais avec la position de leur site de liaison modifié. Les fragments avec le plus grand degré de courbature (donc les plus retardés sur le gel) auront le site de liaison le plus central.