Cours 7- ADN recombinant

Question 1

Quelles sont les 5 étapes du clonage moléculaire?

Answer 1

1) Digestion du fragment d’ADN d’intérêt par des enzymes de restriction = insert pour le clonage
2) Digestion du vecteur de clonage avec des enzymes de restriction.
3) Ligation de l’insert et du vecteur pour la construction du plasmide recombinant.
4) Transformation dans des cellules bactériennes compétentes
5) Isolation du plasmide recombinant et confirmation de la construction moléculaire par digestion/PCR et séquençage.

Question 2

Quelles sont les 5 utilités du clonage moléculaire?

Answer 2

1) Surexpression de protéines recombinantes à des fins de purification
2) Expression de gènes pour des études de génétique ou de physiologie cellulaire
3) Fusions de promoteurs pour des études de profil transcriptionnel
4) Criblages génétiques et génétique bactérienne
5) Séquençage

Question 3

Qu’est ce qu’un gène?

Answer 3

C’est une séquence d’ADN qui code pour une protéine, d’un codon initiateur à un codon STOP.

Question 4

Quels sont les éléments requis pour la transcription d’un gène?

Answer 4

Pour la transcription d’un gène en ARNm, l’ARNpol doit reconnaître le promoteur du gène.

Question 5

Où est situé le départ transcriptionnel?

Answer 5

Entre le promoteur et le RBS.

Question 6

Quels éléments sont en amont du gène?

Answer 6

Le promoteur et le RBS

Question 7

Où est situé le départ traductionnel?

Answer 7

Sur le RBS

Question 8

Quelles sont les sources d’insert pour le clonage?

Answer 8

1) Par PCR spécifique : On peut amplifier grâce à de l’ADN génomique d’un organisme cible, ou à partir d’ADN recombinant. Il y a ajout de sites de restriction requis pour le clonage moléculaire avec amorces.
2) Grâce à un plasmide recombinant : sous-clonage. Il est possible de digérer l’insert contenu dans une construction existante et faire un sous-clonage dans un autre vecteur lorsque les sites de restriction sont compatibles (couper-coller).

Question 9

Vrai ou faux. Les enzymes de restriction sont des exonucléases.

Answer 9

Faux. Ce sont des endonucléases.

Question 10

Que permettent de faire les outils en ligne pour l’analyse des amorces?

Answer 10

• Calculer la Tm des amorces

- Vérifier la probabilité de formation de structures en épingles et de dimérisation des amorces.

Question 11

Pourquoi voudrait-on réaliser une mutagenèse dirigée sur un produit PCR ou une construction plasmidique existante?

Answer 11

1) Corriger une mutation non-conservative introduite dans le gène d’intérêt au cours de l’amplification par PCR
2) Introduire une mutation non conservative pour inactiver l’activité d’une enzyme (mutation catalytique)
3) Introduire une mutation conservative pour éliminer un site de restriction.

Question 12

Vrai ou faux. Les vecteurs de clonage peuvent se répliquer dans les cellules bactériennes via une origine de réplication reconnue par la machinerie de réplication de l’ADN de la cellule hôte.

Answer 12

Vrai.

Question 13

Nommez deux autres manière d’appeler les vecteurs de clonage.

Answer 13

Unités réplicative et plasmides.

Question 14

Deux plasmides dans le même groupes de d’incompatibilité peuvent-ils être maintenus de manière stable dans un hôte? Expliquez.

Answer 14

Non, puisqu’ils sont en compétition pour leur réplication.

Question 15

Vrai ou faux. Deux plasmides ayant des systèmes de réplication différents peuvent être maintenus de manière stable dans un même hôte.

Answer 15

Vrai.

Question 16

Quels sont les deux types de plasmides concernant le nombre de copies?

Answer 16

• Plasmides simple copie

- Plasmide multicopie

Question 17

À quoi est associée la réplication des plasmides à une seule copie?

Answer 17

Elle est strictement associée à la réplication du génome bactérien.

Question 18

Sur quoi est basé la réplication des plasmides multicopies?

Answer 18

Sur l’inhibition de la réplication plasmidique quand les cellules bactériennes ont accumulé un certain nombre de copies.

Question 19

Comment les plasmides vont-ils assurer leur conservation dans les cellules hôtes?

Answer 19

Les plasmides codent pour des sytèmes toxines-antitoxines.

Question 20

Qu’est ce qu’une toxine?

Answer 20

C’est une molécule anti-bactérienne stable

Question 21

Qu’est ce que l’anti-toxine?

Answer 21

C’est une molécule instable qui empêche l’action de la toxine.

Question 22

Le plasmide colE1 permet à E.coli de produire quelle toxine?

Answer 22

La colicine.

Question 23

Vrai ou faux. Tous les vecteurs de clonage possèdent naturellement une séquence RBS.

Answer 23

Faux, certains n’en possèdent pas.

Question 24

Vrai ou faux. Sans séquence RBS, l’expression protéique est possible.

Answer 24

Faux.

Question 25

Vrai ou faux. La séquence RBS est pareille entre les différentes espèces bactériennes.

Answer 25

Faux. La séquence RBS optimale varie entre les espèces.

Question 26

Si un vecteur de clonage ne possède pas de séquence RBS, comment peut-on en inclure une?

Answer 26

1) Inclure une séquence RBS naturelle du gène à cloner dans le produit PCR.
2) Ajouter une séquence RBS (naturelle ou optimale) sur l’amorce forward, en aval du site de restriction et en amont de la séquence d’homologie du gène.

Question 27

Qu’est ce qu’un enzyme de restriction?

Answer 27

C’est une endonucléase qui coupe ou digère l’ADN db suite à la reconnaissance de séquences spécifiques nommées sites de reconnaissance.

Question 28

d’où proviennent les enzymes de restriction?

Answer 28

Ils proviennent d’un mécanisme de défense bactérien contre l’infection par des phages à l’ADN.

Question 29

Quel est le rôle des enzymes de restriction de type I?

Answer 29

Elles vont couper l’ADN après leurs séquences de reconnaissance.

Question 30

On dit que les enzymes de restriction de type I sont des enzymes de type suicide. Qu’est ce que ça veut dire?

Answer 30

Elles seront inactivées après seulement une ronde d’activité.

Question 31

Où clivent les enzymes de restriction de type II sur l’ADN?

Answer 31

Elles clivent dans le site de reconnaissance

Question 32

Vrai ou faux. Dans les enzymes de restriction de type II, il y a une seule unité pour la reconnaissance ou le clivage.

Answer 32

Vrai.

Question 33

Quand on parle d’enzyme de restriction en biomol, on parle du type 1 ou 2?

Answer 33

Du type 2.

Question 34

Que contient un système de restriction/modification bactérien?

Answer 34

Un enzyme de restriction de type II et une méthylase

Question 35

pourquoi les enzymes de restriction sont-ils habituellement utilisées en excès?

Answer 35

Pour assurer des digestions complètes.

Question 36

L’obtention de bouts d’ADN cohésifs ou francs vont favoriser le clonage?

Answer 36

Cohésifs.

Question 37

Vrai ou faux. Les enzymes peuvent être inactivés par la chaleur.

Answer 37

Vrai.

Question 38

Qu’est ce qu’une activité étoile?

Answer 38

Lorsque les conditions de réaction ne sont pas optimales, certains enzyme peuvent avoir cette activité qui leur fera perdre leur spécificité et couper dans des sites de reconnaissance qui ne sont pas les leurs.

Question 39

Comment appelle-t-on un enzyme de restriction qui a peu ou pas d’activité étoile?

Answer 39

Un enzyme de restriction à haute fidélité (HF)

Question 40

Qu’on en commun des plasmides dans le même groupe d’incompatibilité?

Answer 40

Ils ont la même origine de réplication et utilisent la même machinerie moléculaire pour leur réplication.

Question 41

Quelles manipulations peuvent être faites en biologie moléculaire concernant le plasmide ColE1?

Answer 41

Les gènes codant pour la colicine et la protéine d’immunité dans le plasmide sauvage sont remplacés par un gène de résistance à un antibiotique dans le plasmide conçu.
Il y a aussi eu ajout d’une séquence appelée site de clonage multiple qui contient plusieurs sites de reconnaissance pour des enzymes de restriction.
Il y aussi eu ajout d’une séquence promotrice et du RBS en 5’ du site de clonage multiple pour permettre l’expression du gène ou de la séquence clonée.

Question 42

La distance entre le RBS et le codon de départ est peu importante pour l’efficacité de la traduction. Vrai ou faux.

Answer 42

Faux. C’est très important.