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MCB2399-Complément biomol > Cours 11 : Protéomique 1 > Flashcards

Cours 11 : Protéomique 1 Flashcards

1
Q

Nommez les deux méthodes principales de lyse cellulaire.

A

1) Physique (Gel/Dégel, Pression) Désavantages = possibilité de dénaturation
2) Chimique /Enzymatique : Lysosyme + nucléases (moins de chances de dégradation, volumes plus larges)

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Q

Pourquoi précipiter?

A
  • Méthode de purification pour éliminer les proténes contaminant
  • Concentrer les protéines
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3
Q

Quel est le produit le plus utilisé pour la précipitation?

A

Le sulfate d’ammonium

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4
Q

Comment peut-on utiliser la méthode salting out pour la précipitation?

A

En changeant les concentrations de sel en solution, ça peut avoir un effet sur la solubilité de certaines protéines. En d’autres mots, sous certaines conditions de sel, certaines protéines vont avoir tendance à rester solubles ou à précipiter.

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5
Q

Que provoque une très haute teneur ionique?

A

La précipitation - salting out.

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6
Q

Le sulfate d’ammonium est-il un ion kosmotropique ou chaotropique?

A

Kosmotropique

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7
Q

L’urée est-elle un ion kosmotropique ou chaotropique?

A

Chaotropique

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8
Q

Qu’arrive-t-il en augmentant la concentration d’un ion kosmotropique comme le sulfate d’ammonium?

A

Ça permet une précipitation stable.

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9
Q

Qu’arrive-t-il en augmentant la concentration d’un ion chaotropique comme l’urée?

A

Ça permet de dénaturer la protéine : perte de la structure quaternaire, tertiaire et secondaire.

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10
Q

Complétez….
Ion kosmotrophique = ion……..
Ion chaotropique = ion………

A

Ion kosmotrophique = ion STABILISANT

Ion chaotropique = ion DÉNATURANT

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11
Q

Nommez deux techniques qui permettent de modifier le contenu en ions de la solution de protéine avant la purification?

A
  • Dialyse

- Ultrafiltration

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12
Q

Nommez un avantage et un désavantage de l’ultrafiltration.

A

Avantage : plus rapide que la dialyse

désavantage : blocage des filtres.

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13
Q

Expliquez brièvement le principe de purification des protéines par chromatographie.

A

On ajoute un mélange de protéines dans une colonne, puis on ajoute le tampon en haut. Les protéines vont interagir avec la matrice avec des propriétés différentes, ce qui cause l’élution à des temps différents. Les protéines sont ensuite récoltées dans des fractions.

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14
Q

De quoi dépend la charge des protéines?

A

De la séquence en acides aminés (point isoélectrique) et le pH de la solution

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15
Q

Expliquez ce qu’est le point isoélectrique, et son utilisation expérimentale.

A

C’est le différence entre la somme des acides aminés acidiques (asp + glu) et la somme des acides aminés basiques (lys + arg + his).
Expérimentalement, on peut placer une protéine dans un gradient de pH et dans un champ électrique. De cette manière, la protéine va migrer à son pI.

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16
Q

Expliquez brièvement la chromatographie échangeuse d’ions.

A

Cette technique requiert des matrices de chromatographie avec des charges! Si la charge de la matrice est positive, elle va attirer des acides aminés négatifs, et vice versa. Ainsi, les protéines vont se lier différemment selon leur affinité. Il y aura élution avec des quantité croissantes de sels (NaCl ou KCl), et les protéines vont éluer à des concentration de sels différentes.

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17
Q

Comment appelle-t-on les protéines qui ne vont pas lier la matrice, et que vont-elles faire?

A

Elles vont sortir en premier! On appelle cela le flow through.

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18
Q

Quel type de protéines vont éluer à une grande concentration de sels?

A

Des protéines qui sont très fortement liées à la matrice.

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19
Q

Quelle est la différence, dans une chromatographie échangeuse d’ions, entre un gradient linéaire de sels ou une élution en étape au niveau de l’analyse des résultats?

A

Linéaire : plus de pics!

Étape : pics plus larges.

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20
Q

Expliquez brièvement comment on peut obtenir un gradient de concentration différent en sels dans une chromatographie échangeuse d’anions?

A

Il y a deux chambres différentes, reliées entre elles, et qui se déversent dans la colonne de chromatographie. La première chambre est la moins concentrée. Quand elle se vide, la prochaine chambre qui est plus concentrée va déverser son liquide, ce qui va créer une plus grande concentration en sels à la suite de la moins grande concentration.

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21
Q

Nommez deux synonymes à chromatographie sur tamis moléculaire.

A

Chromatographie d’exclusion ou filtration sur gel.

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22
Q

On a trois molécules de masse moléculaire différentes : 10000 Da, 30000 Da, et 100000 Da. Si on fait une chromatographie sur tamis moléculaire, quel sera l’ordre d’élution de ces molécules?

A
  1. 100 000 Da
  2. 30 000 Da
  3. 10 000 Da
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23
Q

Quelle longueur d’onde sera utilisée pour mesurer l’absorbance d’une fraction et identifier si elle possède des protéines?

A

280 nm

24
Q

Vrai ou faux. Deux protéines avec la même taille moléculaire vont éluer en même temps dans la chromatographie sur tamis moléculaire.

A

Vrai.

25
Q

Combien y a-t-il d’acides aminés hydrophobes? Où sont-ils habituellement situés dans la protéine?

A

Il y a 8 acides aminés hydrophobes / 20. La majorité sont cachés à l’intérieur de la protéine.

26
Q

Décrivez les résines les plus utilisés dans la chromatographie aux interactions hydrophobes.

A

Les résines les plus populaires possèdent des groupements hydrophobes liés aux gels d’agarose.

27
Q

Vrai ou faux. Pour la chromatographie aux interactions hydrophobe, on utilise un gradient croissant de sels.

A

Faux. On utilise un gradient décroissant de sel.

28
Q

Sur quoi est basé la chromatographie d’affinité?

A

Sur des liaisons spécifiques d’une protéine pour un ligand (matrice de chromatographie)

29
Q

Expliquez le principe de l’immunoaffinité, ainsi que ses désavantages.

A

Le but est de coupler des Ac polyclonaux ou monoclonaux sur la matrice de chromatographie, pour que ces Ac reconnaissent des épitopes précis sur une protéines. Par contre, il y a plusieurs désavantages :

  • Cout élevé des Ac
  • Couplage inefficace, problème de découplage
  • Élution dans des conditions difficiles (faible pH)
30
Q

Nommez 5 résines utilisées en chromatographie d’affinité pour les protéines recombinantes et leur ligand.

A

1) Résine Ni-NTA : protéines taguées à l’histidine
2) Résine d’amylose : protéines taguées au Maltose Binding Protein (MBP)
3) Résine à glutathione : protéine taguées au glutathione-S-transférase (GST)
4) Chitin (cellulose) : Cellulose binding domain (CBD)
5) Anticorps spécifiques : protéines taguées avec des épitopes HA, FLAG, etc.

31
Q

Expliquez comment on peut faire une élution de protéines avec une matrice de glutathione.

A

Les protéines sont fusionnées au GST, et vont lier le glutathione sur des billes.

Les protéines avec une affinité non spécifique ou faible interaction sont enlevé par lavage.

Ensuite, les protéines fusionnées au GST sont éluées avec le glutathione (compétiteur) ou thrombine (protéase).

32
Q

Qu’est ce qu’une queue histidine, et avec quoi vont-elles intéragir?

A

Les queues histidine sont 6 histidines fusionnées aux extrémités C ou N des protéines recombinantes.

Les queues histidines vont interagir avec du Nickel (ion métallique) sur des billes de résine.

33
Q

Avec quoi sont éluées les protéines avec des queues histidines?

A

Avec de l’imidazole

34
Q

Qu’est ce que le système de chromatographie Batch?

A

C’est un mélange de protéine et matrices in vitro, sans colonne.

35
Q

Qu’est ce que le système de chromatographie FPLC?

A

C’est une chromatographie rapide.

36
Q

Qu’est ce que le système de chromatographie HPLC?

A

C’est une chromatographie à haute pression.

37
Q

Qu’est ce que le système de chromatographie classique?

A

Utilisation d’une faible pression et des colonnes de chromatographie.

38
Q

Sur quoi est basée la séparation lors d’une chromatographie sur colonne?

A

Sur les interactions entre une phase mobile et un support chromatographique (phase stationnaire)

39
Q

Vrai ou faux. La chromatographie sert uniquement à la purification protéique.

A

Faux. On peut également séparer de l’ADN et des ARN.

40
Q

Comment est-ce qu’on peut mesurer l’activité protéique?

A

Ça dépend de la protéine! Mais voici quelques techniques :

  • Activité enzymatique (mesure de l’accumulation du produit, de la diminution du substrat…)
  • Liaison de la protéine
  • Définition d’une unité d’activité.
41
Q

Nommez 3 techniques pour mesurer la quantité de protéines.

A
  • Technique de Bradford ou biuret
  • Absorbance à 280 nm
  • Fluorescence.
42
Q

Quelle technique est plus précise pour mesurer la quantité de protéines? Bradford ou Absorbance?

A

Technique de Bradford.

43
Q

Nommez 4 façon d’établir des conditions dénaturantes dans un SDS-PAGE.

A

SDS, chauffage, DTT ou B-mercaptoéthanol

44
Q

Nommez 3 façons de colorer un gel d’électrophorèse pour visualiser les protéines.

A
  • Bleu de Coomassie
  • Coloration à l’argent (plus sensible)
  • Réactifs fluorescents.
45
Q

Décrivez l’électrophorèse en 2D.

A

Permet la séparation des protéines selon leur taille et leur point isoélectrique.
Chaque tache correspond à une différente protéine. L’horizontale représente la séparation par point isoélectrique, et la verticale la séparation par taille.

46
Q

Quel est le but de l’immunobuvardage (western blot)?

A

Permet la détection d’une protéine spécifique.

47
Q

Le western blot est-il quantitatif ou qualitatif?

A

Quantitatif.

48
Q

Décrivez les étapes de l’immunobuvardage

A 
1- Séparation des protéines par SDS-PAGE
2- Transfert du gel sur une membrane
3- Blocage des régions non spécifiques
4- Incubation avec l'Ac primaire, lavage
5- Incubation avec l'Ac secondaire, lavage
6- Détection de l'Ac secondaire.
49
Q

De quoi est formé la structure primaire d’une protéine?

A

Séquence en acides aminés

50
Q

De quoi est formée la structure secondaire d’une protéine?

A

Feuillets béta et hélice alpha

51
Q

De quoi est formée la structure tertiaire d’une protéine?

A

Arrangement de la structure secondaire en 3D

52
Q

De quoi est formée la structure quaternaire d’une protéine?

A

Arrangements et interactions entre les sous-unités

53
Q

Quelles caractéristiques doivent avoir les vecteurs d’expression pouvant être utilisés chez les bactéries?

A

1) Plasmides multicopies
2) Promoteur fort
3) Signaux de traduction optimisés
4) Usage de codons optimisés
5) Tag d’affinité pour faciliter la purification

54
Q

Quel type de membrane utilise la dialyse?

A

Une membrane semi-perméable.

55
Q

Quel est le but de la dialyse?

A

Changer la composition des solutions.

56
Q

On utilise souvent la chromatographie aux interactions hydrophobes après une certaine étape de traitement. Quelle est-elle?

A

Après une étape de traitement au sulfate d’ammonium.

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