Club technique - Fixation, préparation et colorations usuelles Flashcards
Quels sont les caractéristiques d’un bon agent de fixation?
- Préservation
- Éviter les artéfacts (gonflements, rétraction)
- Rapidité
- Permettre des colorations topographiques
- Permettre l’immunohistochimie - Peu ou pas toxique
Quels sont les Inconvénients des agents de fixation?
- Rétraction pouvant atteindre jusqu’à 50% du volume initial
- Altération de l’ADN et de l’ARN (si acide picrique)
- Artéfacts de fixation: Rétrécissement, gonflement, desquamation Dépôt de carbonate de calcium (pseudocalcification) si formaldéhyde-calcium utilisé Polarisation du glycogène ou effet de fuite, si acidification d’un fixateur alcoolique Formation de pigments
- Altération de la structure des protéines: Crosslinking
- Solubilité des lipides et des carbonhydrates (glycogène) provoque leur perte durant la fixation
Quelle est la vitesse de pénétration du formol et de l’alcool en mm/h, et que devrions-nous faire avec les barrières anatomiques (fascia et capsules) pour faciliter la fixation?
- En moyenne 1mm/h.
- Les barrières anatomiques (fascia ou capsules) doivent être incisées avant la fixation.
Quel volume de liquide du fixateur que nous devrions utiliser?
- 15-20X le volume du tissu
Quels sont les facteurs influençant la fixation?
- Épaisseur et surface du spécimen
- Densité: Plus un tissu est dense, plus il est difficile d’y pénétrer
- Durée de fixation
- Température: La chaleur accélère la fixation
- pH: L’acidité peut provoquer des dépôts de pigments
- Concentration: Formaline 10%, si > ou si <5% peut occasionner artéfacts
quel est le moment idéal pour la fixation (début, durée et fin)?
- Fixer le plus tôt possible idéalement < 30 min
- Pour la formaline, fixer un minimum de 6-8 h et un maximum de 48-72 h
- Varie pour chacun des agents
- Si trop longtemps: effets négatifs (déplacement, réduction et modification de certaines structures)
Quels sont les caractéristiques du Formaldéhyde qu’on utilise de routine (concentration, ph, indications)?
- Solution aqueuse saturée à 40%p/p, considérée comme étant saturée à 100%
- La dilution 1:10 donne la formaline 10%, qui est donc constituée de 4% p/v de formaldéhyde
- pH 6.3 à 6.5
- Indications Fixation de routine Histochimie Immunohistochimie Analyse d’ADN
Quels sont les avantages et incovénients du Formaldéhyde qu’on utilise de routine ?
- Avantages:
- Agent fixateur standard
- mise au point de colorations et d’IHC
- Nécessaire pour cellules lacunaires du lymphome de Hodgkin, variante sclérose nodulaire
- Inconvénients:
- Réaction de cross-linking se produit sur 6-8h
- Temps de fixation plus lent (4mm/24h)
- Coalescence de la chromatine, altérant ainsi la structure du noyau
- Surfixation diminue l’antigénicité
- Dissout les cristaux d’acides uriques, donc fixation dans l’alcool recommandée
- Si fixation > 24h, peut dissoudre les calcifications retrouvées dans le sein
- Volatile : effets toxiques sur les yeux, les voies respiratoires supérieures et la peau
- Cancérigène
Quels sont les caratéristiques du Glutaraldéhyde (indications, avantages, incovénients)?
- Gaz incolore, solution 25%, utilisé 2.5% ou 4%
- Fixe rapidement mais pénètre très mal (fixe les petits fragments de tissus en 2-4h, si 4mm épaisseur, en 24h)
- Indications: Microscopie électronique
- Avantages: Excellente préservation des détails ultrastructuraux cytoplasmiques et nucléaires
- Inconvénients: Très couteux Déconseillé pour l’immunohistochimie Fixation et entreposage à basse température
- Moins irritant que la formaldéhyde
Quels sont les caratéristiques du Éthanol ou méthanol (indications, avantages, incovénients)?
- Agent coagulant
- Déplace rapidement l’eau du tissu et dénature les protéines
- Indications: Les frottis cytologiques, les empreintes et les congélations sont fixés dans le méthanol
- Spécimens synoviaux si la goutte est suspectée, car les cristaux d’acide urique sont dissous dans les fixateurs à base d’eau (formaline)
- Avantages: Antigènes bien préservés
- Inconvénients: Dissout les lipides
Que faut-il voir dans un spécimen bien fixé? Spécimen coloré à l’hématoxyline et à l’éosine
- Les noyaux devraient présenter une variété de patron de chromatine, avec une membrane nucléaire bleu vif.
- Il ne devrait pas y avoir de bulle nucléaire, de flou ou de décoloration.
- Le cytoplasme cellulaire doit être bien préservé et devrait bien se colorer à l’éosine.
- Il ne devrait pas y avoir d’espace artificiel entre les cellules individuelles.
- Il ne devrait pas y avoir de rétrécissement des cellules
Quoi faire pour éviter une fixation incomplète ?
- Veillez à laisser suffisamment de temps pour une bonne fixation
- Assurez-vous que le volume de fixateur est de 15 à 20 fois le volume de tissu.
- Assurez-vous que les coupes sont minces, de préférence pas plus de 3 mm d’épaisseur.
- Changer fréquemment les solutions de formol au cours processus pour prévenir l’épuisement.
Quels sont les caratéristiques des agents de décalcification (examples avec et sans fixation, duration, incovénients)?
- Certains agents fixateurs vont fixer et décalcifier en même temps (Zenker et Bouin)
- Certains agents vont uniquement décalcifier mais le spécimen doit être fixé d’abord
- Peut prendre 1-2h pour décalcifier une petite pièce mais jusqu’à 2 jours pour une tête fémorale
- Inconvénients: Si prolongée, peut affecter la préservation d’antigènes nucléaires (ER, PR, p53 et Ki67) Impossible de faire un FISH ou une technique de détection de l’ADN
Quelles sont les étapes du traitement des tissus en pathologie (de la macroscopie à la production de lames)?
- Coupes de 2-5mm du tissu afin de voir les petites lésions
- Placer le tissu dans une cassette
- Fixation
- Processeur : Déshydratation (Remplacement de l’eau par l’alcool, l’alcool par un solvent organique, le solvent organique par la paraffine) Lavage Infiltration dans bloc de paraffine
- Coupe au microtome (4μm) du tissu inclus dans le bloc de paraffine
- Étalement sur une lame
- Dans certaines circonstances, des niveaux peuvent être requis (espacés de 20μm)
- Séchage
- Coloration
- Montage
Quels sont les caratéristiques de la coloration Hématoxyline et de la coloration éosine?
- Hématoxyline :
Molécule naturelle qui n’est pas un colorant mais acquiert une couleur après son oxydation (naturelle ou chimique) en hématéine, un faible colorant acide jaunerougeâtre = hématoxyline
Afin d’augmenter son affinité pour les tissus, on le lie à mordant, un sel de métal (fer, aluminium, chrome ou tungstène) = laque d’hématéine
Après la combinaison, la « laque d’hématéine » devient alors un colorant basique, qui colore en jaune-rougeâtre les composantes cellulaires basophiles (composantes acides), comme l’acide nucléique
Donc une étape de bleuissement essentielle, car sa coloration rougeâtre ne permettrait pas assez de contraste avec l’éosine
Le noyau apparait alors en bleu
-Éosine:
Parce qu’elle est soluble dans l’eau et l’alcool, elle teint le cytoplasme et les fibres du tissu conjonctif
Colorant acide qui agit directement sur le tissu, colorant les composantes cellulaires acidophiles (composantes basiques) en différentes nuances de rose vers le rouge
Quelles sont les causes possibles des problèmes rencontrés dans les situations suivantes:
-Voir réponses
quels sont les 2 groupes de fixateurs et leurs caractéristiques principales?
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