caractérisation des interactions Flashcards
C’est quoi une interactions
C’est les interactions entre les composantes de la machinerie biochimique des cellules organisant la matière, l’information, et les transformations d’énergie pour permettre des fonctions spécifique
C’est quoi l’équation de la liaison d’un ligand à un site d’une macromolécule
M+X –Ka> MX
C’est quoi l’équation de la constante d’association
Ka = [MX]/([M][X])
C’est quoi l’équation de la constante de dissociation
Kd = 1/Ka = ([M][X])/[MX]
C’est quoi l’équation pour estimer le pourcentage de macromolécule lié
%Mlié = [MX]/([M]+[MX])
C’est quoi l’équation pour estimer le pourcentage de ligand lié
%Xlié = [MX]/([X]+[MX])
Que son les facteurs déterminé pour la formation de complexes in vivo
Les conditions physico-chimiques, le bon repliement, la compartimentalisation, les modifications et la présence de cofacteurs
Comment est ce que la co-immunoprécipitation (co-IP) fonctionne
Elle fonctionne par la sélection d’une protéine connue par son anticorps et ses partenaires de liaisons. il est possible de détecter des protéines spécifiques à l’aide d’anticorps. Elle ne peut pas démontrer si l’interaction est directe ou indirecte
Comment est ce qu’on démontre les interaction par co-IP avec WB
Avoir une hypothèse de l’identité, posséder des anticorps anti-A et anti-B et interaction stable en présence du détergent utilisé pour la lyse cellulaire
Que sont les avantages de la co-immunoprécipitation
Elle peut démontrer des interactions entre protéines endogènes qui ont lieu dans une cellule
Que sont les inconvénients de la co-immunoprécipitation
Il faut génèrer des anticorps spécifiques , on ne peut pas affirmer que l’intéraction soit directe, des interactions peuvent être détruites par la lyse et le traitement et faux positifs créés par la lyse
C’est quoi l’avantages de protéine avec étiquettes et co-IP
La même étiquette peut être réutilisée et l’ajout de deux étiquettes permet une double purification
C’est quoi l’inconvénients de protéine avec étiquettes et co-IP
C’est l’ajout de l’étiquette peut masquer un site de liaison ou en créer un nouveau site artificiel et expression à partir de vecteurs d’expression
Comment la détection peut être adaptée pour le criblage à haut débit
En combinant la méthode de co-IP avec des études de protéomiques basées sur la spectrométrie de masse
Que sont les avantages de la détection des protéines co-IP par spectrométrie de masse
Permet le criblage à haut débit des protéines d’interaction, quand le génome est séquencé il est possible de chercher les banques de données pour identifier le gène qui correspond aux peptides obtenus
Que sont les inconvénients de la détection des protéines co-IP par spectrométrie de masse
Possibilités de faux positifs, car l’identification de protéines à partir de banques de données est complexe, des peptides ne peuvent pas être identifier, les expériences doivent être répétées pour assurer la reproductibilité et la grande quantité de données sont difficile à interpreter
C’est quoi l’immunoprécipitation de la chromatine (ChIP)
C’est une variante de la méthode co-IP pour l’identification d’interactions ADN-protéines
Que sont les résultats du ChIP
Ces des fragments enrichis d’ADN lié à une protéine particulière
Comment est déterminé le fragment avec ChIP
L’identité du fragment d’ADN est déterminé par séquençage ChIPseq qui est un séquençage à haut débit
Comment on fait l’identification d’ARN liant les protéines par RIP et CLIP
Utilisation d’anticorps pour isoler des complexes ribonucléoprotéiques
C’est quoi RIP
C’est ARN-immunoprecipitation par crosslink
C’est quoi la variante de RIP
C’est RIP natif et nRIP prévient les artéfacts de crosslink, mais pas les artéfact de réassociation
C’est quoi CLIP
C’est UV-crosslinked immunoprecipitation
C’est quoi la variante de CLIP
C’est par-CLIP qui fait que la formation du crosslink est plus efficace et permet l’identification précise du site de liaison
Comment fonctionne l’essai de marquage par proximité
La protéine est fusionné à une enzyme qui va marquer d’autre protéine, c’est enzyme permettent l’ajout de biotine aux protéines, les protéines sont enrichies puis analyser par M/S
l’essai de marquage par proximité est effectué avec quoi
Avec un contrôle négatif appelée référence spatiale
C’est quoi la streptavidine
C’est une protéine tétramérique qui a une affinité record pour la biotine qui permet de purifier les protéines conjuguées à la biotine
C’est quoi l’avantage de l’essai de marquage par proximité
Permet de déterminer les protéines à proximité de notre protéine d’intérêt dans la cellule avant la lyse et permet de déterminer la localisation cellulaire de notre protéine indirectgement
Que sont les inconvénients de l’essai de marquage par proximité
Ne mesure pas la présence d’interactions entre la protéine appât et les protéines marquées par la biotine juste la proximité, la fusion entre la ligase et notre protéine d’intérêt peut créer des faux positif et négatifs, et nécessite l’expression exogène de la protéine fusion ce qui peut créer des artéfacts
Comment on construit les deux protéines hybrides du système double-hybride
On fusionne la protéine cible avec le domaine de liaison à l’ADN d’un activateur transcriptionnel et on fusionne le domaine activateur d’un activateur transcriptionnel, avec diverse protéines ou divers fragments dans le but d’identifier un partenaire de liaison
Pourquoi les gènes recombinant sont introduits chez la levure
Pour être exprimés
Qu’est ce quand les deux protéines hybrides interagissent
La transcription du rapporteur est activée, et peut être détectée
Que sont les avantages du concept du double hybride
les interactions sont direct, pas d’hypothèse, peut analyser des interactions précises et peut être adapté au criblage à haut débit
Que sont les inconvénients du concept du double hybride
Plusieurs faux positif causé par la dépendance sur la surexpression de protéines fusion et on peut pas inférer une absence d’interaction
Qu’est ce que la méthode de complémentation de fragment protéiques (PCA) fait
Elle permet la détection d’interactions entre protéines à des niveaux endogènes
Que sont les avantages du PCA
Permet l’étude in vivo, très sensible, adapté à plusieurs type cellulaires, adapté à diverses application
Que sont les inconvénients du PCA
Tendance à l’auto-assemblage des fragments protéiques et la création de protéines de fusion peut masquer un site de liaison ou en créer un nouveau site artificiel
Qu’est ce que l’accumulation de données sur des interactions protéine-protéine permet
Elle permet d’établir des cartes d’interactions qui aboutissent à l’interactome
C’est quoi un interactome
C’est l’ensemble des interactions moléculaires dans la cellule
Comment est ce qu’on quantifie les interaction
par une verification des interactions in vitro avec des macromolécules purifiées et la résonance plasmonique, la calorimétrie et le retard sur gel
C’est quoi l’équation de l’énergie libre de liaison
G=RT*ln(Kd) = H - TS
C’est quoi l’affinité
C’est la force de l’interaction non-covalente mesurée par le Ka/Kd. Plus l’affinité est grande plus le Ka est élevée et le Kd est faible
C’est quoi la spécificité
C’est la capacité d’une molécule de lier un ligand par rapport à certains autres
C’est quoi la résonance plasmonique de surface (SPR)
C’est une méthode biophysique qui permet de détecter en temps réel des interactions sur une molécule attachée à une surface
Que fait SPR
Elle permet de visualiser en temps réel des interactions entre biomolécules non marquées dans un débit continu de tampon
Qu’est ce qui arrive durant un SPR
Un des réactifs est retenu sur une interface appelée sensor chip, l’analyte dilué dans un tampon circule à flux constant à la surface du biocapteur et l’association ou dissociation modifient la réfringence du milieu et décalent la position de l’angle de résonance
C’est quoi un sensorgramme
C’est l’enregistrement de la variation de l’angle de résonance qui permet de suivre en temps réel la fixation des molécules injectées sur le biocapteur
Qu’est ce qui produit un sensogramme
l’enregistrement du signal de résonance qui est exprimé en unité de résonance (RU)
C’est quoi les équations d’association et dissociation avec sensogramme
Ka = kass/kdiss et Kd = kdiss/kass
Que sont les avantages de SPR
étude d’interaction en temps réel. applicable à un grand nombre de molécules, plus de deux partenaires, rapide, données cinétiques et thermodynamiques et pas de marqueurs
Que sont les inconvénients de SPR
immobilisation d’une molécule sur une surface peut interférer et on peut pas évaluer l’homogénéité
C’est quoi la calorimétrie à titrage isotherme
C’est une méthode biophysique qui permet de mesurer la chaleur générée ou absorbée par une interaction moléculaire en solution
Qu’est ce qui arrive durant une expérience ed calorimétrie typique
Une solution est titrée dans une solution du partenaire de liaison dans la cellule expérimentales et il y a une chaleur produite ou absorbée, puis le système mesure et compense pour la différence en chaleur
Que sont les données brutes de la calorimétrie
La puissance requise pour maintenir la différence en chaleur à chaque injection
Qu’est ce que l’intégrale de la puissance permet
Elle permet de mesurer la chaleur résultante du processus qui est ensuite porté sur graphique en fonction des ratios molaires du ligand par rapport à son partenaire
Que sont les avantages de la calorimétrie à titrage isotherme
Elle permet de déterminer tous les paramètres de liaison, mesure directement Kd, pas de marquage
Que sont les inconvénients de la calorimétrie à titrage isotherme
peut pas être déterminer si deltaH est faible ou nul, nécessite beaucoup de matériel, ne permet pas de mesure l’homogénéité
Qu’est ce que le retard sur gel permet
Il permet de déterminer si une protéine interagit avec une séquence donnée et d’établir dans certains cas
Que sont les avantages du retard sur gel d’électrophorèse
facile à réalisé, pas beaucoup de matériel, mesure directement le Kd, révèle des complexe et la stœchiométrie, définie le site de liaison d’acide nucléique et permet de vérifier l’homogénéité conformationnelle de nos macromolécules
Que sont les inconvénients du retard sur gel d’électrophorèse
pas équilibrer, l’ARN doit être marqué, les complexes instable sont difficiles à détecter et difficile à réaliser avec de petits peptides
