Block 9: Methoden zur Analyse und Manipulation von DNA Flashcards
Aufbau eines Vektors
Besteht aus einem ORI (Origin of Replication), einem Selektionsmarker wie einem Antibiotika-Resistenzgen und einem Bereich, in den das Zielgen insertiert werden kann.
Was ist ein Restriktionsenzym? Wie sehen deren zu erkennende Schnittstellen aus?
Restriktionsenzyme schneiden DNA an Stellen mit festgelegter Sequenz.
Sequenzen sind meist Palindrome
Warum erfolgt in Bakterien eine Methylierung von Basen?
Methylierte Basen schützen vor den Restriktionsenzymen -> Restriktionsendonukleasen zur Abwehr von Fremd-DNA wirken nicht bei der eigenen DNA
Gelelektrophorese, wie wirkt Ethidiumbromid?
DNA-Fragmente nach Ladung und Größe getrennt
Dient der Visualisierung der gewanderten DNA -> verändert Absorptionsspektrum durch Interkalierung mit Nukleinsäuren
UV-Licht verstärkt den Effekt
Wie funktioniert die Sequenzierung nach Sanger?
Es werden 4 verschiedene PCRs durchgeführt, jeweils mit einem dNTP durch ein ddNTP (Didesoxynukleotidtriphosphat) ersetzt. An der Stelle wo es eingefügt wird -> keine Kettenverlängerung, da Ribose keine OH-Gruppe mehr hat -> unterschiedlich langen Fragmenten
Die viel Durchläufe werden auf Gel aufgebracht und können abgelesen werden. Primer darf nur für eine Richtung verwendet werden
Chemische Synthese von DNA. In welcher Richtung erfolgt sie und warum ist keine beliebige
Länge möglich?
erfolgt von 5’ -> 3’-Richtung
Weil jedes einzelne Nukleotid in einem aufwendigen Verfahren angehängt wird.
-> Reaktionszeit lang und Ausbeute nimmt mit der Länge der synthetisierten Kette rasch ab
Chemische Synthese von Peptiden. Warum Länge nicht beliebig möglich?
Weil mit zunehmender Zahl der AS die Ausbeute stark abnimmt. Da bei jedem Arbeitsschritt eine gewisse Menge des Peptids verloren geht
Was ist der Southern Blot?
Dient dem Nachweis von DNA. Verdau mit Restriktions-Enzymen und Auftrennung durch Gelelektrophorese. Gel wird auf Nitrocellulosemembran aufgebracht (geblottet) und fixiert. Membran wird dann mit einer markierten Gensonde behandelt, die zum gesuchten DNA-Stück komplementär ist. Diese Basenpaarung kann dann nachgewiesen werden
Was ist der Northern blot?
Dient dem Nachweis von mRNA. Selber Ablauf wie Southernblot
Was ist der Western blot?
Dient dem Nachweis von Proteinen. Proteingemisch durch Gelelektrophorese aufgetrennt. Elektrisches Feld wird senkrecht zum Polyacrylamid-Gel angelegt -> Proteine wandern auf eine Membran und bleiben dort haften. Durch AK können die Proteine nachgewiesen werden
PCR
Dient der Vervielfältigung von DNA.
3 Schritte:
1. Denaturierung: Doppelsträngige DNA wird auf 94-96°C erhitzt -> um Stränge zu trennen, Auftrennung der H-Brücken; abkühlen
- Primerhybridisierung: Temperatur 30 Sekunden auf einem Wert gehalten -> spezifische Anlagerung der Primer findet statt
- Elongation: DNA-Polymerase füllt fehlende Stränge mit freien Nukleotiden auf. Beginnt am 3’-Ende des angelagerten Primers und folgt DNA-Strang. Primer nicht abgelöst -> bildet Anfang des neuen Einzelstranges
In welchen Organismen werden rekombinante Proteine normalerweise überexprimiert?
meist in E. coli, S. cerevisiae oder Insektenzellen
Wie funktioniert die gerichtete Mutagenese?
Mit Vektoren soll eine Punktmutation eingeführt werden. Man verwendet Primer mit gewünschter Mutation. Mit der PCR wird das rekombinante Zielgen amplifiziert. Mutanten Primer annealen am normalen DNA-Template und erzeugen rekombinante DNA. Template wird nun durch Restriktionsenzyme zerstört -> nur noch rekombinante DNA vorhanden. Restliche Komponenten des Plasmids werden ebenfalls über PCR erzeugt und mit Zielgen zusammengeführt. Vektor wird in Zielorganismen eingebracht.
