Avaliação da resposta imune

Question 1

Imunoensaio

Answer 1

• Ensaios que detetam ou quantificam uma substância específica (analito), numa
  amostra biológica usando o princípio da reação anticorpo – antigénio
• AC policlonais
  # Anticorpos dirigidos para o mesmo antigénio, mas para diferentes epítopos. Exigem vários clones
  de células B a serem reconhecidos para os diferentes epítopos.
• Exemplo: se eu tiver o vírus Influenza da gripe, no meu soro encontrarei anticorpos contra o vírus:
  são policlonais porque tive uma célula B a reconhecer a hemaglutinina, outra a reconhecer uma
  proteína da cápsula do vírus, outra a reconhecer a neuroaminidase e por aí fora. Todas reconhecem
  o vírus mas em zonas diferentes.
• Uma resposta nossa normal a um antigénio é uma resposta policlonal- inserir ag nos animais e colher AC

Question 2

AC monoclonais

Answer 2

1- isolamento cel B com colheita nos ganglios e baço após imunização de rato com AG
2- fusão com cel do mieloma com plasmocitos (promoção do polietilenoglicol)- hibridoma (cels tumorais com enzima envolvida no metabolismo de purinas e pirimidinas cortadas, portnato so as que são hibridomas é que sobrevivem)
3- diluições consecutivas (limite)
4- cels hibridoma individuais clonadas
5- AC monoclonal- para 1 epítopo

Question 3

Tecnicas de imunoensaio

Answer 3

• Reações de Precipitação
  a. Dupla Difusão
  b. Imunodifusão Radial (IDR)
  c. Imunoeletroforese contracorrente
  d. Imunoeletroforese
  e. Imunoeletroforese Rocket
  d. Imunofixação – confirmação de bandas malignas (doenças como mieloma múltiplo)
• Reações de Aglutinação
• Métodos que avaliam a dispersão da luz
  a. Nefelometria
  b. Turbidimetria
• Métodos que utilizam marcadores/sondas
  a. EIA (Enzyme Immuno Assay)
  b. FIA (Fluoro Immuno Assay)
  c. Immunoblot (Western Blot)
  d. Imunofluorescência Direta
  e. Imunofluorescência Indireta (IFI)

Question 4

Reações de precipitação

Answer 4

• técnicas que permitem dosear proteínas solúveis, às quais se ligam anticorpos. - Formam-se imunocomplexos que, por ter maior peso molecular, precipitam.

Question 5

Imunodifusão radial simples (IDR): técnica manual

Answer 5

• Utilização de geis permitem que proteínas migrem entre os poros das suas malhas.
• Antigene solúvel (que pode estar no soro de um doente, por exemplo) depositado nos poços
  de um gel; esse gel contém anticorpos à volta
• Antigene difunde em todas as direções
  -Quando se atingem concentrações de equivalência do antigene com o anticorpo que está no
  gel formam-se
  complexos imunes que precipitam em aneis concêntricos
• Através do diâmetro dos halos pode fazer-se uma correlação com a concentração de
  antigénio – quanto maior o diâmetro do anel formado, maior a concentração de antigénio
  APLICAÇÕES IDR:
  A IDR é essencialmente utilizada para fazer ensaios sem opção automática.
  # Quantificação de Imunoglobulinas (incluindo subclasses de IgG)
  # Quantificação de fatores de complemento (C5-C9, p.e.) e outras proteínas séricas
  Se quiser estudar p.ex eritrocitos uso aglutinação
  APLICAÇÕES:
  Testes rápidos – situações urgentes
  # Tipagem Sanguínea (Sistema AB0, Rh)
  # Deteção de anticorpos anti-eritrocitários
  # Identificação de agentes microbianos: Permitem fazer diagnósticos presuntivos –
  precisam de confirmação
  # Deteção e titulação de anticorpos anti-agentes microbianos

Question 6

Reações de aglutinação

Answer 6

• reações que se baseiam na interação entre anticorpos e antigénios particulados, em vez de
  solúveis. Quando se formam imunocomplexos, dá-se uma reação de aglutinação, visível a olho nu.
• No fundo, uma reação de aglutinação é a possibilidade de um anticorpo se ligar a vários antigenes
  (p.e. vários eritrócitos) formando um agregado de células
• testes qualitativos: apenas dizem se existem anticorpos contra antigenes específicos que
  estávamos a procurar
• O sistema AB0 é “A, B, zero”. Zero porque na superfície da hemácia não temos nem o antigénio A,
  nem o B.
• Uma pessoa que seja do grupo sanguíneo A, tem no seu soro anticorpos anti-B
• Uma pessoa do grupo 0, tem no seu soro anticorpos anti-A e anticorpos anti-B
• Uma pessoa do grupo B, tem no seu soro anticorpos anti-A
• Estes antigénios (A e B) são na verdade carboidratos que também se encontram na superfície de
  muitas bactérias. Então, desde muito cedo, as bactérias comensais mostram estes antigénios para
  naturalmente nós os produzirmos e isto quer dizer que estes antigénios até são apelidados de
  “antigénios naturais”

Question 7

Aglutininas

Answer 7

• Imunoglobulina M: devido à possibilidade de formar pentâmeros é uma aglutinina por excelência,
  na medida em que tem uma grande capacidade de fixação de antigénios
• Imunoglobulina G: é uma aglutinina pobre porque exige condições ótimas de temperatura e pH
  para ocorrer a reação.

Question 8

Métodos que avaliam a dispersão da luz

Answer 8

Ensaios automatizados e rápidos
- Avaliam a interação entre o imunocomplexo e uma radiação que o atravessa
- Junta-se um reagente, com anticorpo específico, a uma amostra, que pode ser o soro de um
doente
- Se se formarem muitos imunocomplexos, a solução da cuvete de reação fica turva, pelo que há menos luz transmitida e mais luz refratada
# Nefelometria: mede a intensidade da luz refratada – diretamente proporcional à quantidade de
imunocomplexos
# Turbidimetria: mede a intensidade da luz direta – inversamente proporcional à quantidade de
imunocomplexos
APLICAÇÕES:
Ensaios automatizados
# Doseamento de imunoglobulinas
# Doseamento de fatores de complemento (C3, C4, CH100 via classica, AH50 via alternativa)
# Doseamento de proteínas de fase aguda (PCR, alfa1antitripsina, ceruloplasmina, haptoglobina. f. reumatoides, título anti-estreptolisina O, …)

Question 9

Métodos que utilizam marcadores/sondas

Answer 9

• quando não é suficiente termos so complexos imunes
• marcador pode ser radioisótopo, enzima, flurescência,..
• Ensaio direto:
  #Deteta antigene
  #Anticorpo marcado (p.e. com fluorescência) e atua no antigene
  #Antigene presente: fluorescência
  # AG-AC marcado
• Ensaio indireto:
  #Deteta se estão presentes anticorpos anti-antigene X
  #Ex: posso achar que doente tem anticorpo anti-DNA. Então marco anticorpo secundário que vai
  reconhecer o anticorpo primário que está ligado ao núcleo das células (DNA)
  # AG-AC-AC marcado
• Ensaio Competitivo Indireto ou Inibição
  Competitivo
  # AG- AG-AC-AC marcado
• Ensaio competitivo direto
  # AC- AG AGmarcado
• Sandwich: ensaios ao contrário: na placa estão anticorpos e não antigénios sendo que o objetivo é
  procurar o antigénio no sangue do doente, e não o anticorpo
  # Simples: Serve para estudar antigénio. Coloca-se um anticorpo específico para o antigene que se
  quer dosear numa placa
  -Ex: se eu quiser dosear IL-1, arranjo Ac anti-IL-1 que está agarrado a uma placa, a IL-1 liga-se e
  depois outro Anticorpo liga-se também
  # Dupla: AC-AC-AG-AC-AC marcado

Question 10

EIA (enzyme imunno assay)

Answer 10

• tem por base o método sandwich
• Utiliza as propriedades catalíticas das enzimas
• O mais conhecido é o ELISA (Enzyme-linked Immuno Sorbent Assay), mas tambem há o MEIA, EMIT, CEDIA, …
• Marco o anticorpo com uma enzima (Ac-E) e este Ac-E vai-se ligar a um antigene.
• Avalia-se alteração das concentrações do substrato ou produto de degradação, sendo
  que os produtos têm normalmente alteração de cor
  # Placas: têm anticorpo anti-X. Coloca-se soro do doente na placa e se houver antigene presente, liga
  se o antigene X ao anticorpo, na proporção da sua concentração
• Depois junto um anticorpo secundário com uma enzima acoplada e estando presente o antigénio-X, a enzima atua no seu
  substrato e aumenta a concentração dos produtos de reação – quanto mais mudança de cor houver,
  maior a concentração de antigénio
  ENZIMAS: fosfatase alcalina, peroxidase de rabano (horseradish- hrp)
• glicose-6-fosfato desidrogenase, beta- galactosidase
  APLICAÇÕES
• Doseamento de Imunoglobulinas, cadeias leves e subclasses
• Doseamento e avaliação funcional de fatores do Complemento
• Monitorização de serologias infeciosas (HIV, HBV, HCV, HAV, CMV, Rubéola,Toxoplasma,…)
  -Monitorização da imunização (Pneumococos, Tétano, Varicela,…)
  -Doseamento de Marcadores tumorais (CEA, PSA,…)
  -Doseamento de Hormonas
• ELISpot: ensaios para avaliação da produção de citocinas e perforinas

Question 11

FIA (fluoroimunno assay)

Answer 11

• Permite doseamento de imunoglobulinas do soro; particularmente útil no doseamento de Igs nas reações de hipersensibilidade
• Utiliza-se uma caneta que tem na superfície alergénios (antigénio em fase sólida), faz-se com que o soro do doente atravesse a matriz com os alergénios e ficam agarrados os anticorpos que reconhecem estes alergénios (anticorpo da amostra).
• Utilizando um anticorpo secundário
  marcado com uma enzima contra o anticorpo que se ligou ao alergénio, obtemos um substrato
  com fluorescência. Mais fluorescência = mais imunoglobulinas contra alergénio
• • Há interesse em fazer vários destes testes ao mesmo tempo em reações cruzadas (tenho de ter testes de screening e testes confirmatórios)
    APLICAÇÕES
    -FPIA: Doseamento do hormonas tiroideias (Tiroxina T4)
• FEIA: Doseamento de IgE total e IgE específicas, IgAs e IgGs específicas
  (Estudo das Reações de Hipersensibilidade)
  -Doseamento de Proteína Catiónica Eosinofílica, Triptase
  -Anticorpos autoimunes
  -ISAC: Avaliação de IgEs específicas, IgGs e IgAs específicas
  (Estudo das Reações de Hipersensibilidade ––antigénios moleculares)

Question 12

Immunoblot (Western blot)

Answer 12

• teste confirmatório
• Deteta proteínas específicas e implica:
  # Separação das proteínas num gel de poliacrilamida.
  # Transferência (blotting) das proteínas do gel para uma membrana estável (nitrocelulose, nylon,…).
  # Identificação da proteína com um anticorpo específico
  # permite detetar proteínas em misturas complexas
  # menos sensível que outros imunoensaios (ex: ELISA) mas é mais específico
  ensaio à confirmatório.
  # Permite caracterizar algumas propriedades das proteínas e fazer a sua quantificação
• Deteção da ligação ao AC (anticorpo marcado primário ou secundário com radioisótopo, complexo enzima-substrato cromogénico ou fluorescente ou quimioluminescente ou …)
• se tivermuos duvidas da reatividade cruzada (p. ex VHB e influenza, em vez do soro do doente ter uma replica igual do vhb ia ter só o AG que partilha ou é parecido com o influenza) –> bom teste confirmatório!
  APLICAÇÕES
  # Ensaios confirmatórios de reações de hipersensibilidade mediadas por IgE, serologias infecciosas como HIV, HBV, …, ou autoanticorpos
  (EIA+–>IMUNOBLOT+–>POS; SE FOR IMUNOBLOT - —> STOP)

Question 13

Imunofluorescência direta

Answer 13

• Anticorpo e antigénio em ligação direta com observação em microscópio de fluorescência
  1- Anticorpo específico marcado com fluorocromo (FITC, PE, Rodamina B,…).
  2- É aplicado diretamente sobre o corte de tecido/cultura celular onde se quer identificar o antigénio (que pode ou não existir aí).
  3- Elimina-se depois o excesso de anticorpo que não se ligou ao antigénio, lavando.
  4- Verifica-se se houve ou não formação do complexo imune, num microscópio de
  fluorescência
  APLICAÇÕES
  # Localização morfológica de Antigénios situados na superfície celular

Question 14

Imunofluorescência indireta

Answer 14

• serve p.ex para identificar anticorpo anti-DNA
  1- Anticorpo específico e um segundo anticorpo marcado com fluorocromo (FITC, PE, Rodamina B,…).
  2- Colocar o soro do doente sobre um substrato adequado (corte de tecido/cultura celular) com antigénio.
  3- Adicionar antiglobulina humana (segundo anticorpo) marcada com fluorescência.
  4- Verificar no microscópio de fluorescência se há ou não fluorescência.
  APLICAÇÕES
  # Deteção de autoanticorpos (ANA, ANCA, ASMA, anti-TSH).
  # Deteção de anticorpos contra agentes infeciosos (bactérias, vírus, fungos, parasitas,…).
  #…
• No contexto da imunofluorescência vamos ter sempre lavagem como na ELISA mas com a
  particularidade de se usar depois os microscópios de fluorescência
• Reconhecer na imunofluorescência o que é que fica marcado na célula.
• Identificar intensidade da fluorescência, que é proporcional à quantidade de anticorpo.
• no screening das doenças auto-imunes (imunofluorescência células Hep2–> positivo com título >1:160

Question 15

Células que se utilizam para avaliar as vias clássicas e alternativa

Answer 15

eritrócitos porque são mais sucestiveis a ação do complemento devido a ausência do núcleo –> lise
- Assim, o
CH100 e o AH50 avaliam a capacidade hemolítica do complemento da via clássica e alternativa
respectivamente
- Não utilizo eritrócitos humanos porque as nossas células estão protegidas pelo nosso
complemento e porque eticamente e em termos de disponibilidade é mais complicado

Question 16

Se só AH50 alterado o que dosear?

Answer 16

fator B, D, P etc

Question 17

Se só CH100 alterado o que dosear?

Answer 17

C1, c2, c4, etc

Question 18

Doseamento dos fatores de complemento

Answer 18

• nefelo/turbidi (c3 e c4)
• elisa (outros)
• IDR (outros)

Question 19

estudos funcionais do complemento

Answer 19

ELISA, IDR

Question 20

Painel de testes gravida para toxoplamsose, rubéola e CMV

Answer 20

TORCH
se ocorrer primeira infeção durante a gravidez, há critério para interrupção
- só IgM +—> infeção ativa e 1ª infeção porque ainda não houve tempo para fazer seroconversão
- só IgG +–> imune, sem risco para bebé
- IgM e IgG +–> reativação da infeção
- Se eu contactei há pouco tempo com o agente da Toxoplasmose, as minhas imunoglobulinas
ainda não “tiveram tempo” para criar muita afinidade para esse agente
- Quanto mais as células passarem pelo centro germinativo, com mais afinidade/”força”
elas se ligam ao AG, maior a avidez
- baixa avidez IgG—> infeção recente e não podemos excluir primeira infeção –> consulta de gravidez de risco
- Alta avidez IgG-.–> excluímos primeira infeção–> não há risco

Question 21

Serologias virais e doenças congénitas

Answer 21

• quimioluminescência
• ELISA, EIA
• Imunofluorescência indireta

Question 22

Ensaios confirmatórios de Serologias virais e doenças congénitas

Answer 22

• Imunoblot

- Biologia molecular

Question 23

Deposição de anticorpos e c3 e c4 diminuidos

Answer 23

Doença autoimune ativa

Question 24

Fator reumatóide

Answer 24

Anticorpo anti-IgG

Question 25

AC para LES

Answer 25

Anti -dsDNA e Anti-Sm

as vezes associado a anti-cardiolipina por SAAF secundário

Question 26

AC anti-fosfolipidos

Answer 26

• anti-cardiolipina
• Anticoagulante lúpico
• anti-beta2-glicoproteina1

Question 27

Screening de auto-anticorpos

Answer 27

• imunofluorescência indireta

Question 28

Ensaios confirmatórios de autoanticorpos

Answer 28

• ensaio imunoenzimáticos
• immunoblot
• reações de precipitação
• Ensaios multiplex

Question 29

Anti corpos antinucleares (AAN/ANA)

Answer 29

- Quando há algumas
suspeitas de respostas autoimunes ou manifestações muito atípicas, fazemos o screening com
anticorpos antinucleares (AAN/ANA)
- Contra proteínas, ácidos nucleicos, nucleoproteínas
- 3-15% da população tem AAN+ (títulos baixos), sem estar associado a doença
- Deteção por:
#Imunofluorescência Indireta (IFI): células Hep2
# Imunoprecipitação
# ELISA
# Immunoblot
# Luminex
- Na Imunofluorescência Indireta avaliamos estruturas nucleares e também as mitoses!
Se são anticorpos antinucleares e se grande parte das vezes faço o teste com
imunofluorescência, preciso de células sobretudo epitelióides com núcleo proeminente
- cromatina também importante porque nas mitoses fica condensada (se cromossomas aparecem fluorescentes na mitose diz-se mitose pos)
- Celulas hep2- substrato preferencial para pesquisa de ANA

Question 30

4 padroes de mitoses

Answer 30

• Se o núcleo aparece todo imunofluorescente de forma
  homogénea, os anticorpos que estão a ser reconhecidos são
  os anti-DNA (padrão difuso). Se só parte do núcleo é que
  está imunofluorescente temos anticorpos contra outras
  enzimas do núcleo
• DIFUSO/HOMOGÉNEO
  #Não específico.
  #Segundo padrão mais comum.
  #Acs contra componentes dos cromossomas (dsDNA, histonas e
  nucleosomas).
  #Cromatina com coloração intensa, uniforme.
  #Mitoses positivas
• MOSQUEADO
  #Não específico.
  #Padrão mais comum.
  #Acs contra “antigénios nucleares extraíveis – ENAs” (anti-RNP, Sm,
  SSA,…)
  #Cromatina sem coloração.
  #Mitoses negativas
• CENTRÓMERO/
  centromérico
  #Específico para o Síndrome de CREST* (ES limitada) e Cirrose
  biliar primária.
  #Padrão que ocorre devido a Acs dirigidos contra os centrómeros.
  #Pequenos pontos fluorescentes (46- 1 por cada cromossoma) no
  núcleo.
  #Pontos fluorescentes agrupados ao longo do eixo mitótico.
  #Mitoses positivas
• NUCLEOLAR
  # Relativamente específico para ES (esclerose sistémica) Difusa.
  #Padrão que ocorre devido a Acs dirigidos contra os nucléolos (2 a 7)
  #Pode surgir associado a outros padrões.
  #Mitoses: a cromatina das células em divisão pode aparecer
  negativa, positiva, ou ter alguns pontilhados.
• Para além do padrão também é importante avaliar o título para valorizar ou não um título
  baixo ou para monitorizar a evolução do titulo destes anticorpos de um doente com patologia
  confirmada. Fazemos varias diluições da nossa amostra e vemos em qual delas é que deixamos de
  ter fluorescência.

Question 31

defice c5?

Answer 31

• defeciente formação de MAC (infeções por bacterias como a neisseria)
• sindrome lupus-like por deficiente remoção de imuncomplexos (sem opsoninas)

Question 32

Doseamento de IGs e proteinas de fase aguda

Answer 32

• Nefelo/turbidi
• ELISA
• IDR
• Eletroforese de proteinas séricas

Question 33

Estudo da monoclonalidade das IGs

Answer 33

Imunofixação

• Imunoeletroforese
• Eletroforese de proteínas séricas

Question 34

Eletroforese

Answer 34

• quando submetidas a um campo elétrico, as proteinas são separadas consoante as cargas e massa
• utilizam-se géis com uma malha de poros de dimensão controlada (agarose, acrilamida)
• a separação eletroforética depende de: pH do meio, força iónica da solução tampão
• A separação é visualizada usando corante sensível a proteinas
• a leitura é realizada com densitómetro capaz de medir o perfil eletroforético (% e valor absoluto de cada fração proteica)

Question 35

Pré-albumina

Answer 35

• transtirretina, retinol binding protein
• sintetizada pelo fígado
• transporte de tiroxina e derivados da vit A
• normalmente não visíveis
• baixos niveis podem sugerir reações de fase aguda, má nutrição proteica ou doença hepática

Question 36

Albumina

Answer 36

Proteína + abundante no soro
- sintese figado
- transporte de subs
- manutenção da pressão oncótica
- Aumentada
# desidratação
- Diminuida
# baixa prod no fígado (má nutrição, DH)
# aumento da perda ou degradação (sindrome nefrótico, queimaduras)
# inflamação crónica ou aguda
# gravidez
# analbuminémia congénita
- Bisalbuminémia
#congénita
#drogas
#pancreatites agudas

Question 37

Região alfa 1

Answer 37

• 90% alfa 1 antitripsina
• 10% - thyroid binding globulin, alfafetoproteina, alfa 1 glicoproteina acida, alfa1 lipoproteina- HDL
• sintese figado
• Aumentada
  # inflamação aguda ou crónica
  # neoplasias (ex: aum alfafeto por hepatocarcinoma)
  # pós-trauma ou cirurgia
  # gravidez ou estrogenioterapia
• DIminuida
  # def em alfa 1 antitripsina (cirrose e enfisema)
  # doença hepática (dim da prod)

Question 38

Região alfa 2

Answer 38

• Haptoglobina, ceruloplasmina, alfa 2 macroglobulina
• sintese figado
• resposta um pouco mais tardia
• Aumentada
  # prot de fase aguda (cerulo e hapto)
  # aum da alfa 2 macro or sindrome nefrótico (associada a baixa alb)
• Diminuida
  # baixa cerulo (d. wilson, ma nutrição, s. nefrotico, enteropatia com perda de proteina)
  # baixa hapto (hepatopatias grave, anemia megalo ou hemolise, hemolise intravascular) - marcador mais sensivel da hemolise porque se liga a Hb apos hemolise

Question 39

Região beta

Answer 39

• beta1 :transferrina, beta lipoproteina, outros fatores do complemento
• beta2: c3
• IgA, IgM e IgG podem tambem aparecer
• Aumentada
  # aum da transferrina (anemia ferropénica, gravidez e terapia estrogénica)
  # aum beta lipoproteina (hipercolesterolemia de tipo II, hipotiroidismo, cirrose biliar, sindrome nefrotico, DM)
  # aum C3 (inflamação, HT maligna, D. cushing, carcinoma)
• DIminuida
• dim transferrina (inflamação aguda - diminui sintese hepatica, prot de fase aguda negativa)
• dim C3 (def genetica)

Question 40

Região gamma

Answer 40

• inclui Igs (maioritariamente IgG)
• IgM e IgD migram proximo da região beta
• IgA migra entre a região beta e gamma (como a PCR)
• Aumentada
  # sindromes
  linfoplasmociticos
  # hiperimunizações
  # infeções agudas
  # doença hepatica/inflamatória cronica
  # neoplasia disseminada
• DIminuida
  # idade
  # deficiência congénita ou adquirida
  # Tratamento imunossupressor (VIH, transplante,…)

Question 41

Doença de Bruton

Answer 41

• falta tirosina-cinase de Bruton (enzima importante no desenvolvimento e diferenciaçãode linf B)
• a partir dos 6 meses quando já não há compensação de AC da mão ha agamaglobulinemia

Question 42

Pico policlonal vs monoclonal

Answer 42

• pico policlonal o que
  estamos a ver é essa variedade de proteínas representada, por estar aumentada. Se, por outro
  lado, tivermos um pico fino, de base estreita como o da albumina, vamos ter o aumento de um só tipo de imunoglobulina, com as mesmas cadeias, a mesma especificidade. Este é um pico
  monoclonal.
• Eu tenho provavelmente um
  clone tumoral, ou seja, uma célula da linhagem B que está a secretar o seu anticorpo em excesso.
  Está a proliferar e a ter uma sobreprodução desta proteína que vai ser excretada para o soro.
  Mas como é que eu posso provar que aquele pico é de facto monoclonal? Para comprovar a monoclonalidade de um pico
  de base estreita na eletroforese fazemos agora um ensaio de confirmação, que pode ser uma
  imunoeletroforese ou uma imunofixação, que nos vai dizer qual é a cadeia leve e qual é a
  cadeia pesada daquela amostra. Se ela tiver várias, não é monoclonal

Question 43

Imunoeletroforese do soro

Answer 43

• amostra em paralelo com soro controlo normal
• também se pode fazer na urina
• são tipo espelho se tiver tudo normal
• lê-se de baixo para cima
• coloca-se anti-soros que são anticorpo contra Igs e cadeias levesentre o soro controlo e doente

Question 44

Imunofixação

Answer 44

• Soro, urina, LCR
• gel de agarose
• faz-se eletroforese 6x para se colocar AC contra todas as Igs (IgG, A,M e cadeias leves) - tira de acetato de celulose com antisoro embebido–> precipitação de imunocomplexos com posterior coloração
• primeira linha são proteinas do soro com a albumina no topo

Question 45

Proteínas de Bence jones

Answer 45

- São proteínas monoclonais ou
imunoglobulinas de cadeia leve
encontrado na urina, com um peso
molecular de 22 a 24 kDa. A
presença destas proteínas na urina
pode ser sugestiva de mieloma
múltiplo ou Macroglobulinemia
de Waldenstrom
- devido a sobrecarga renal

Question 46

Imunofixação no LCR

Answer 46

• gamapatia, doença desmielinizante
• Imunofixação soro e depois LCR – se estiver igual houve passagem e é provavel gamapatia, se houver prod intra-tecal –> esclerose multipla ou em infeção
• faz sentido mielograma no mieloma multiplo, e do ponto de vista da avaliação proteica imunofixação, eletroforese e doseamento de cadeias leves

Question 47

hipogamaglobulinémia

Answer 47

Doença de Bruton, hipogamaglobulinemias transitoria de infância, defice CD40L (não ha classe switch)

Question 48

Testes laboratoriais de gamapatias monoclonais

Answer 48

• Eletroforese de proteínas séricas
• Imunofixação/
  Imunoeletroforese (soro, urina)
• Doseamento de imunoglobulinas
• Doseamento de cadeiras leves integrais (normalmente pela concentração de IgG,A,M)
• Doseamento de cadeias leves livres séricas (quando a Ig está formada a região detetada não esta exposta- não da para dosear) - as cadeias leves livres são filtradas pelo rim ao nivel do glumerulo e reabs nos tubulos renais (filtração de monomeros K (eliminação 2-4h) é 3x mais rapida que dimeros lambda(eliminação 3-6h)) - soro contem razão K: lambda 0,625
• Se tenho rim com
  lesão e começo a
  perder proteínas indiscriminadamente, a
  razão de cadeias k/lambda na
  urina está mantida. Se o aumento
  de proteína estiver associado
  sobretudo a um aumento k ou lambda é indício
  de gamapatia monoclonal

Question 49

Razão K:lambda Igs policlonais

Answer 49

1,5 a 2:1

Question 50

Aumento serico de CLL monoclonais

Answer 50

MM, Mieloma CLL, amiloidose, doença deposição cadeias leves

Question 51

Citometria de fluxo

Answer 51

• A citometria de fluxo é um equipamento que tem 3 sistemas que
  permitem a caracterização
  individualizada de cada célula que os
  atravessa:
• Sistema de fluidos
• Sistema Ótico
• Sistema Eletrónico
• No sistema de fluidos, a amostra vai
  ser aspirada e os fluidos vão empurrar
  e pressurizar as células, de forma a
  que fiquem todas em “fila indiana”
  uma a uma, para passarem em frente
  à câmara, onde vão entrar em
  contacto com 2 lasers. Quando a
  célula passa, surgem interrupções no feixe do laser
• A 180 graus vamos ter noção do tamanho da célula em função da “barra de escurecimento” –
  forward scatter. A 90 graus vamos ter o side scatter, correspondendo à complexidade (ou
  seja, se a luz bate na célula e é refletida a 90 graus). Por exemplo se passar um linfócito têm se
  muita luz a atravessar pois este não é complexo, se for um eosinófilo, como há muitos grânulos,
  chega menos luz ao detetor pois esta é refletida. Num hemograma, surge uma contagem
  diferencial das diversas populações; com estes dois scatters é possível obter logo estes
  resultados
• só da para fluidos e se quisermos biopsia temos que liquidificar
• utiliza fluorescência (detetada atraves do sistema otico) - Por exemplo, se se marcar o CD3 com um anticorpo monoclonal
  fluorescente verde anti CD3, os linfócitos T aparecem verdes; se marcar CD19 a vermelho, os
  linfócitos B emitem luz vermelha. Assim, à medida que as células passam à frente do laser
  percebe-se qual a fluorescência que emitem, o que dará origem aos seguintes gráficos (dot plot)
  geridos pelo sistema eletrónico do citómetro:

Question 52

Citometria fluxo marcadores

Answer 52

• CD3 e CD4
• CD3 e CD8
• CD19
• CD16 (recetor baixa afinidade para IgG) e 56
• CD45 para todos leucócitos

Question 53

Citometria fluxo contagem subpopulações

Answer 53

• Temos de colocar as
  células do sangue com anticorpos
  monoclonais e lisar os
  eritrócitos, se não só
  haveria eritrócitos e
  não leucócitos na
  análise direta no
  citómetro
• Há doentes que fazem a cada 2/3 meses para avaliar a contagem dos CD4 não só para o
  diagnóstico e prognostico, mas também para monitorização da terapêutica e estabelecimento da
  imunodeficiência primaria. No contexto dos VIH, devemos verificar os CD4, perceber como está
  a função imune dos doentes. Não só no diagnóstico de Sida, mas até na monitorização
  terapêutica dos doentes, a contagem dos CD4 é crucial.

Question 54

Aplicaçoes clinicas da citometria fluxo

Answer 54

• estudo e caracterização de imunodef
• VIH/SIDA - valor abs cd4 (prognostico, profilaxia, terapeutica, diagnostico)
• estudo e caracterização autoimunes
• despiste leucemias/ linfomas

Question 55

Razão CD4/CD8 normal

Answer 55

2

Question 56

Cel CD4 ara sida

Answer 56

abaixo 200 cel/microlitro

Question 57

Particularidade de Razão neutrofilo/linfocito

Answer 57

está invertida nas crianças ha mais linfocitos

Question 58

Linfopenia T em crianças

Answer 58

• bebé não tenha timo,
  (situação rara mas muito grave), síndrome de DiGeorge, ou uma SCID (Severed combined immune deficiency). Este bebé não pode receber vacinas vivas, nem transfusões, e são
  necessários vários outros cuidados. É proposto para transplante

Question 59

Estudo fagocitose

Answer 59

-dermos
bactérias
fluorescentes aos neutrófilos conseguimos verificar se eles
são ou não capazes de fagocitar. De seguida põem-se as
células a 37ºC, depois passam-se as células pelo laser, se
emitir luz é porque fagocitou as bactérias.
(A 0ºC não acontece fagocitose) - se ganham fluorescência fagocitaram

Question 60

Estudo do burst oxidativo

Answer 60

• A NADPH oxidase produz radicais livres de O2,
  peróxido e óxido nítrico, podendo também atuar
  noutros substratos como a dihidrorodamina 123.
  Se o burst oxidativo se encontrar normal esta é
  degradada num produto
  fluorescente, a
  RODAMINA123. Pegamos nos neutrófilos e vemos
  como estão em repouso e quando recebem
  estímulo e comparamos os resultados. O estímulo
  chama-se PMA neste caso, e vemos esta janela
  traçada é a janela de neutrófilos, tamanho e
  complexidade. Quando se dá dihidrorodamina, no
  estado basal, os neutrófilos não fazem nada, por outro lado, quando se dá a PMA, (o estimulo
  real), “saltam” e emitem fluorescência o que significa que degradaram a dihidrorodamina e estão
  funcionais. Fazendo a razão de fluorescência do grupo em estado basal e do grupo que recebeu
  o estimulo obtém-se o índice oxidativo normal – NOI (normal oxidative index)- que deve ser
  sempre superior a 30

Question 61

Doença granulomatosa crónica

Answer 61

• doentes apresentam-se com abcessos de
  repetição muito cedo
  e complicações
  ligadas à dificuldade
  em eliminar o patogéneo- NOI a baixo do normal
• forma def da NADPH oxidase
• ligada ao cromossoma X (cada neutrófilo escolhe qual cromossoma X
  quer ativar, uns ativam o X doente e outros
  o normal - 2 populações de neutrófilos - as vezes temos 2 NOI)
• Há a possibilidade de ter as formas autossómicas
  não ligadas aos cromossomas sexuais. (Raro)

Question 62

Fagocitose diminuida

Answer 62

- def neutrofilo:
# associada a alt complemento (Ex: c3bi)
# associada a baixa Ig
# trauma, DM, falha renal
# SIDA

Question 63

fagocitose aumentada

Answer 63

• imunomodeladores (IL-2, IFN gamma, Ácido lático)

Question 64

Alt metabolismo oxidativo

Answer 64

• Doença granulomatosa crónica

- Transplante, SIDA e idade (metabolismo oxidativo dim)

Question 65

Avaliação função/proliferação linfócitos

Answer 65

• PBMCs - mononucleares- linfócitos e monócitos ( Estes mononucleados têm uma menor densidade, assim
  se pusermos o sangue a centrifugar com uma substância que tenha
  uma densidade entre
  os polimorfonuceados
  e os mononucleados “Ficoli”, vão ficar separados.
• Muitas vezes faz-se esta avaliação colocando as células em cultura e vendo se proliferam.
  Normalmente estas células proliferam se tiverem estimulo, depois de aplicar o estímulo, damos
  um composto radioativo. Se ficarem todas cheias de radioatividade, dividiram e integraram o
  nucleótido radioativo. O resultado é avaliado por um computador que analisa o índice células
  estimuladas e não estimuladas
• Hoje em dia é possível fazer isto sem
  radioatividade, administra-se nas células
  um corante fluorescente e com a divisão
  este vai
  repartindo o corante em
  quantidade igual pelas células filhas. Se o
  corante começar a desvanecer e diminuir
  de intensidade é porque
  houve proliferação
• indice de estimulação (SI)= cel estimuladas/ cel não estimuladas
• Útil por
  exemplo numa criança ainda com SCID visto que há defeito ligado aos linfócitos, desde a
  produção de citocinas à função citotóxica e à capacidade de proliferação..