Avaliação da resposta imune Flashcards
1
Q
Imunoensaio
A
- Ensaios que detetam ou quantificam uma substância específica (analito), numa
amostra biológica usando o princípio da reação anticorpo – antigénio - AC policlonais
# Anticorpos dirigidos para o mesmo antigénio, mas para diferentes epítopos. Exigem vários clones
de células B a serem reconhecidos para os diferentes epítopos. - Exemplo: se eu tiver o vírus Influenza da gripe, no meu soro encontrarei anticorpos contra o vírus:
são policlonais porque tive uma célula B a reconhecer a hemaglutinina, outra a reconhecer uma
proteína da cápsula do vírus, outra a reconhecer a neuroaminidase e por aí fora. Todas reconhecem
o vírus mas em zonas diferentes. - Uma resposta nossa normal a um antigénio é uma resposta policlonal- inserir ag nos animais e colher AC
2
Q
AC monoclonais
A
1- isolamento cel B com colheita nos ganglios e baço após imunização de rato com AG
2- fusão com cel do mieloma com plasmocitos (promoção do polietilenoglicol)- hibridoma (cels tumorais com enzima envolvida no metabolismo de purinas e pirimidinas cortadas, portnato so as que são hibridomas é que sobrevivem)
3- diluições consecutivas (limite)
4- cels hibridoma individuais clonadas
5- AC monoclonal- para 1 epítopo
3
Q
Tecnicas de imunoensaio
A
- Reações de Precipitação
a. Dupla Difusão
b. Imunodifusão Radial (IDR)
c. Imunoeletroforese contracorrente
d. Imunoeletroforese
e. Imunoeletroforese Rocket
d. Imunofixação – confirmação de bandas malignas (doenças como mieloma múltiplo) - Reações de Aglutinação
- Métodos que avaliam a dispersão da luz
a. Nefelometria
b. Turbidimetria - Métodos que utilizam marcadores/sondas
a. EIA (Enzyme Immuno Assay)
b. FIA (Fluoro Immuno Assay)
c. Immunoblot (Western Blot)
d. Imunofluorescência Direta
e. Imunofluorescência Indireta (IFI)
4
Q
Reações de precipitação
A
- técnicas que permitem dosear proteínas solúveis, às quais se ligam anticorpos. - Formam-se imunocomplexos que, por ter maior peso molecular, precipitam.
5
Q
Imunodifusão radial simples (IDR): técnica manual
A
- Utilização de geis permitem que proteínas migrem entre os poros das suas malhas.
- Antigene solúvel (que pode estar no soro de um doente, por exemplo) depositado nos poços
de um gel; esse gel contém anticorpos à volta - Antigene difunde em todas as direções
-Quando se atingem concentrações de equivalência do antigene com o anticorpo que está no
gel formam-se
complexos imunes que precipitam em aneis concêntricos - Através do diâmetro dos halos pode fazer-se uma correlação com a concentração de
antigénio – quanto maior o diâmetro do anel formado, maior a concentração de antigénio
APLICAÇÕES IDR:
A IDR é essencialmente utilizada para fazer ensaios sem opção automática.
# Quantificação de Imunoglobulinas (incluindo subclasses de IgG)
# Quantificação de fatores de complemento (C5-C9, p.e.) e outras proteínas séricas
Se quiser estudar p.ex eritrocitos uso aglutinação
APLICAÇÕES:
Testes rápidos – situações urgentes
# Tipagem Sanguínea (Sistema AB0, Rh)
# Deteção de anticorpos anti-eritrocitários
# Identificação de agentes microbianos: Permitem fazer diagnósticos presuntivos –
precisam de confirmação
# Deteção e titulação de anticorpos anti-agentes microbianos
6
Q
Reações de aglutinação
A
- reações que se baseiam na interação entre anticorpos e antigénios particulados, em vez de
solúveis. Quando se formam imunocomplexos, dá-se uma reação de aglutinação, visível a olho nu. - No fundo, uma reação de aglutinação é a possibilidade de um anticorpo se ligar a vários antigenes
(p.e. vários eritrócitos) formando um agregado de células - testes qualitativos: apenas dizem se existem anticorpos contra antigenes específicos que
estávamos a procurar - O sistema AB0 é “A, B, zero”. Zero porque na superfície da hemácia não temos nem o antigénio A,
nem o B. - Uma pessoa que seja do grupo sanguíneo A, tem no seu soro anticorpos anti-B
- Uma pessoa do grupo 0, tem no seu soro anticorpos anti-A e anticorpos anti-B
- Uma pessoa do grupo B, tem no seu soro anticorpos anti-A
- Estes antigénios (A e B) são na verdade carboidratos que também se encontram na superfície de
muitas bactérias. Então, desde muito cedo, as bactérias comensais mostram estes antigénios para
naturalmente nós os produzirmos e isto quer dizer que estes antigénios até são apelidados de
“antigénios naturais”
7
Q
Aglutininas
A
- Imunoglobulina M: devido à possibilidade de formar pentâmeros é uma aglutinina por excelência,
na medida em que tem uma grande capacidade de fixação de antigénios - Imunoglobulina G: é uma aglutinina pobre porque exige condições ótimas de temperatura e pH
para ocorrer a reação.
8
Q
Métodos que avaliam a dispersão da luz
A
Ensaios automatizados e rápidos
- Avaliam a interação entre o imunocomplexo e uma radiação que o atravessa
- Junta-se um reagente, com anticorpo específico, a uma amostra, que pode ser o soro de um
doente
- Se se formarem muitos imunocomplexos, a solução da cuvete de reação fica turva, pelo que há menos luz transmitida e mais luz refratada
# Nefelometria: mede a intensidade da luz refratada – diretamente proporcional à quantidade de
imunocomplexos
# Turbidimetria: mede a intensidade da luz direta – inversamente proporcional à quantidade de
imunocomplexos
APLICAÇÕES:
Ensaios automatizados
# Doseamento de imunoglobulinas
# Doseamento de fatores de complemento (C3, C4, CH100 via classica, AH50 via alternativa)
# Doseamento de proteínas de fase aguda (PCR, alfa1antitripsina, ceruloplasmina, haptoglobina. f. reumatoides, título anti-estreptolisina O, …)
9
Q
Métodos que utilizam marcadores/sondas
A
- quando não é suficiente termos so complexos imunes
- marcador pode ser radioisótopo, enzima, flurescência,..
- Ensaio direto:
#Deteta antigene
#Anticorpo marcado (p.e. com fluorescência) e atua no antigene
#Antigene presente: fluorescência
# AG-AC marcado - Ensaio indireto:
#Deteta se estão presentes anticorpos anti-antigene X
#Ex: posso achar que doente tem anticorpo anti-DNA. Então marco anticorpo secundário que vai
reconhecer o anticorpo primário que está ligado ao núcleo das células (DNA)
# AG-AC-AC marcado - Ensaio Competitivo Indireto ou Inibição
Competitivo
# AG- AG-AC-AC marcado - Ensaio competitivo direto
# AC- AG AGmarcado - Sandwich: ensaios ao contrário: na placa estão anticorpos e não antigénios sendo que o objetivo é
procurar o antigénio no sangue do doente, e não o anticorpo
# Simples: Serve para estudar antigénio. Coloca-se um anticorpo específico para o antigene que se
quer dosear numa placa
-Ex: se eu quiser dosear IL-1, arranjo Ac anti-IL-1 que está agarrado a uma placa, a IL-1 liga-se e
depois outro Anticorpo liga-se também
# Dupla: AC-AC-AG-AC-AC marcado
10
Q
EIA (enzyme imunno assay)
A
- tem por base o método sandwich
- Utiliza as propriedades catalíticas das enzimas
- O mais conhecido é o ELISA (Enzyme-linked Immuno Sorbent Assay), mas tambem há o MEIA, EMIT, CEDIA, …
- Marco o anticorpo com uma enzima (Ac-E) e este Ac-E vai-se ligar a um antigene.
- Avalia-se alteração das concentrações do substrato ou produto de degradação, sendo
que os produtos têm normalmente alteração de cor
# Placas: têm anticorpo anti-X. Coloca-se soro do doente na placa e se houver antigene presente, liga
se o antigene X ao anticorpo, na proporção da sua concentração - Depois junto um anticorpo secundário com uma enzima acoplada e estando presente o antigénio-X, a enzima atua no seu
substrato e aumenta a concentração dos produtos de reação – quanto mais mudança de cor houver,
maior a concentração de antigénio
ENZIMAS: fosfatase alcalina, peroxidase de rabano (horseradish- hrp) - glicose-6-fosfato desidrogenase, beta- galactosidase
APLICAÇÕES - Doseamento de Imunoglobulinas, cadeias leves e subclasses
- Doseamento e avaliação funcional de fatores do Complemento
- Monitorização de serologias infeciosas (HIV, HBV, HCV, HAV, CMV, Rubéola,Toxoplasma,…)
-Monitorização da imunização (Pneumococos, Tétano, Varicela,…)
-Doseamento de Marcadores tumorais (CEA, PSA,…)
-Doseamento de Hormonas - ELISpot: ensaios para avaliação da produção de citocinas e perforinas
11
Q
FIA (fluoroimunno assay)
A
- Permite doseamento de imunoglobulinas do soro; particularmente útil no doseamento de Igs nas reações de hipersensibilidade
- Utiliza-se uma caneta que tem na superfície alergénios (antigénio em fase sólida), faz-se com que o soro do doente atravesse a matriz com os alergénios e ficam agarrados os anticorpos que reconhecem estes alergénios (anticorpo da amostra).
- Utilizando um anticorpo secundário
marcado com uma enzima contra o anticorpo que se ligou ao alergénio, obtemos um substrato
com fluorescência. Mais fluorescência = mais imunoglobulinas contra alergénio - Há interesse em fazer vários destes testes ao mesmo tempo em reações cruzadas (tenho de ter testes de screening e testes confirmatórios)
APLICAÇÕES
-FPIA: Doseamento do hormonas tiroideias (Tiroxina T4)
- Há interesse em fazer vários destes testes ao mesmo tempo em reações cruzadas (tenho de ter testes de screening e testes confirmatórios)
- FEIA: Doseamento de IgE total e IgE específicas, IgAs e IgGs específicas
(Estudo das Reações de Hipersensibilidade)
-Doseamento de Proteína Catiónica Eosinofílica, Triptase
-Anticorpos autoimunes
-ISAC: Avaliação de IgEs específicas, IgGs e IgAs específicas
(Estudo das Reações de Hipersensibilidade ––antigénios moleculares)
12
Q
Immunoblot (Western blot)
A
- teste confirmatório
- Deteta proteínas específicas e implica:
# Separação das proteínas num gel de poliacrilamida.
# Transferência (blotting) das proteínas do gel para uma membrana estável (nitrocelulose, nylon,…).
# Identificação da proteína com um anticorpo específico
# permite detetar proteínas em misturas complexas
# menos sensível que outros imunoensaios (ex: ELISA) mas é mais específico
ensaio à confirmatório.
# Permite caracterizar algumas propriedades das proteínas e fazer a sua quantificação - Deteção da ligação ao AC (anticorpo marcado primário ou secundário com radioisótopo, complexo enzima-substrato cromogénico ou fluorescente ou quimioluminescente ou …)
- se tivermuos duvidas da reatividade cruzada (p. ex VHB e influenza, em vez do soro do doente ter uma replica igual do vhb ia ter só o AG que partilha ou é parecido com o influenza) –> bom teste confirmatório!
APLICAÇÕES
# Ensaios confirmatórios de reações de hipersensibilidade mediadas por IgE, serologias infecciosas como HIV, HBV, …, ou autoanticorpos
(EIA+–>IMUNOBLOT+–>POS; SE FOR IMUNOBLOT - —> STOP)
13
Q
Imunofluorescência direta
A
- Anticorpo e antigénio em ligação direta com observação em microscópio de fluorescência
1- Anticorpo específico marcado com fluorocromo (FITC, PE, Rodamina B,…).
2- É aplicado diretamente sobre o corte de tecido/cultura celular onde se quer identificar o antigénio (que pode ou não existir aí).
3- Elimina-se depois o excesso de anticorpo que não se ligou ao antigénio, lavando.
4- Verifica-se se houve ou não formação do complexo imune, num microscópio de
fluorescência
APLICAÇÕES
# Localização morfológica de Antigénios situados na superfície celular
14
Q
Imunofluorescência indireta
A
- serve p.ex para identificar anticorpo anti-DNA
1- Anticorpo específico e um segundo anticorpo marcado com fluorocromo (FITC, PE, Rodamina B,…).
2- Colocar o soro do doente sobre um substrato adequado (corte de tecido/cultura celular) com antigénio.
3- Adicionar antiglobulina humana (segundo anticorpo) marcada com fluorescência.
4- Verificar no microscópio de fluorescência se há ou não fluorescência.
APLICAÇÕES
# Deteção de autoanticorpos (ANA, ANCA, ASMA, anti-TSH).
# Deteção de anticorpos contra agentes infeciosos (bactérias, vírus, fungos, parasitas,…).
#… - No contexto da imunofluorescência vamos ter sempre lavagem como na ELISA mas com a
particularidade de se usar depois os microscópios de fluorescência - Reconhecer na imunofluorescência o que é que fica marcado na célula.
- Identificar intensidade da fluorescência, que é proporcional à quantidade de anticorpo.
- no screening das doenças auto-imunes (imunofluorescência células Hep2–> positivo com título >1:160
15
Q
Células que se utilizam para avaliar as vias clássicas e alternativa
A
eritrócitos porque são mais sucestiveis a ação do complemento devido a ausência do núcleo –> lise
- Assim, o
CH100 e o AH50 avaliam a capacidade hemolítica do complemento da via clássica e alternativa
respectivamente
- Não utilizo eritrócitos humanos porque as nossas células estão protegidas pelo nosso
complemento e porque eticamente e em termos de disponibilidade é mais complicado
16
Q
Se só AH50 alterado o que dosear?
A
fator B, D, P etc
17
Q
Se só CH100 alterado o que dosear?
A
C1, c2, c4, etc
18
Q
Doseamento dos fatores de complemento
A
- nefelo/turbidi (c3 e c4)
- elisa (outros)
- IDR (outros)
19
Q
estudos funcionais do complemento
A
ELISA, IDR
20
Q
Painel de testes gravida para toxoplamsose, rubéola e CMV
A
TORCH
se ocorrer primeira infeção durante a gravidez, há critério para interrupção
- só IgM +—> infeção ativa e 1ª infeção porque ainda não houve tempo para fazer seroconversão
- só IgG +–> imune, sem risco para bebé
- IgM e IgG +–> reativação da infeção
- Se eu contactei há pouco tempo com o agente da Toxoplasmose, as minhas imunoglobulinas
ainda não “tiveram tempo” para criar muita afinidade para esse agente
- Quanto mais as células passarem pelo centro germinativo, com mais afinidade/”força”
elas se ligam ao AG, maior a avidez
- baixa avidez IgG—> infeção recente e não podemos excluir primeira infeção –> consulta de gravidez de risco
- Alta avidez IgG-.–> excluímos primeira infeção–> não há risco
21
Q
Serologias virais e doenças congénitas
A
- quimioluminescência
- ELISA, EIA
- Imunofluorescência indireta
22
Q
Ensaios confirmatórios de Serologias virais e doenças congénitas
A
- Imunoblot
- Biologia molecular
23
Q
Deposição de anticorpos e c3 e c4 diminuidos
A
Doença autoimune ativa
24
Q
Fator reumatóide
A
Anticorpo anti-IgG
25
AC para LES
Anti -dsDNA e Anti-Sm
| as vezes associado a anti-cardiolipina por SAAF secundário
26
AC anti-fosfolipidos
- anti-cardiolipina
- Anticoagulante lúpico
- anti-beta2-glicoproteina1
27
Screening de auto-anticorpos
- imunofluorescência indireta
28
Ensaios confirmatórios de autoanticorpos
- ensaio imunoenzimáticos
- immunoblot
- reações de precipitação
- Ensaios multiplex
29
Anti corpos antinucleares (AAN/ANA)
```
- Quando há algumas
suspeitas de respostas autoimunes ou manifestações muito atípicas, fazemos o screening com
anticorpos antinucleares (AAN/ANA)
- Contra proteínas, ácidos nucleicos, nucleoproteínas
- 3-15% da população tem AAN+ (títulos baixos), sem estar associado a doença
- Deteção por:
#Imunofluorescência Indireta (IFI): células Hep2
# Imunoprecipitação
# ELISA
# Immunoblot
# Luminex
- Na Imunofluorescência Indireta avaliamos estruturas nucleares e também as mitoses!
Se são anticorpos antinucleares e se grande parte das vezes faço o teste com
imunofluorescência, preciso de células sobretudo epitelióides com núcleo proeminente
- cromatina também importante porque nas mitoses fica condensada (se cromossomas aparecem fluorescentes na mitose diz-se mitose pos)
- Celulas hep2- substrato preferencial para pesquisa de ANA
```
30
4 padroes de mitoses
- Se o núcleo aparece todo imunofluorescente de forma
homogénea, os anticorpos que estão a ser reconhecidos são
os anti-DNA (padrão difuso). Se só parte do núcleo é que
está imunofluorescente temos anticorpos contra outras
enzimas do núcleo
- DIFUSO/HOMOGÉNEO
#Não específico.
#Segundo padrão mais comum.
#Acs contra componentes dos cromossomas (dsDNA, histonas e
nucleosomas).
#Cromatina com coloração intensa, uniforme.
#Mitoses positivas
- MOSQUEADO
#Não específico.
#Padrão mais comum.
#Acs contra “antigénios nucleares extraíveis – ENAs” (anti-RNP, Sm,
SSA,...)
#Cromatina sem coloração.
#Mitoses negativas
- CENTRÓMERO/
centromérico
#Específico para o Síndrome de CREST* (ES limitada) e Cirrose
biliar primária.
#Padrão que ocorre devido a Acs dirigidos contra os centrómeros.
#Pequenos pontos fluorescentes (46- 1 por cada cromossoma) no
núcleo.
#Pontos fluorescentes agrupados ao longo do eixo mitótico.
#Mitoses positivas
- NUCLEOLAR
# Relativamente específico para ES (esclerose sistémica) Difusa.
#Padrão que ocorre devido a Acs dirigidos contra os nucléolos (2 a 7)
#Pode surgir associado a outros padrões.
#Mitoses: a cromatina das células em divisão pode aparecer
negativa, positiva, ou ter alguns pontilhados.
- Para além do padrão também é importante avaliar o título para valorizar ou não um título
baixo ou para monitorizar a evolução do titulo destes anticorpos de um doente com patologia
confirmada. Fazemos varias diluições da nossa amostra e vemos em qual delas é que deixamos de
ter fluorescência.
31
defice c5?
- defeciente formação de MAC (infeções por bacterias como a neisseria)
- sindrome lupus-like por deficiente remoção de imuncomplexos (sem opsoninas)
32
Doseamento de IGs e proteinas de fase aguda
- Nefelo/turbidi
- ELISA
- IDR
- Eletroforese de proteinas séricas
33
Estudo da monoclonalidade das IGs
Imunofixação
- Imunoeletroforese
- Eletroforese de proteínas séricas
34
Eletroforese
- quando submetidas a um campo elétrico, as proteinas são separadas consoante as cargas e massa
- utilizam-se géis com uma malha de poros de dimensão controlada (agarose, acrilamida)
- a separação eletroforética depende de: pH do meio, força iónica da solução tampão
- A separação é visualizada usando corante sensível a proteinas
- a leitura é realizada com densitómetro capaz de medir o perfil eletroforético (% e valor absoluto de cada fração proteica)
35
Pré-albumina
- transtirretina, retinol binding protein
- sintetizada pelo fígado
- transporte de tiroxina e derivados da vit A
- normalmente não visíveis
- baixos niveis podem sugerir reações de fase aguda, má nutrição proteica ou doença hepática
36
Albumina
```
Proteína + abundante no soro
- sintese figado
- transporte de subs
- manutenção da pressão oncótica
- Aumentada
# desidratação
- Diminuida
# baixa prod no fígado (má nutrição, DH)
# aumento da perda ou degradação (sindrome nefrótico, queimaduras)
# inflamação crónica ou aguda
# gravidez
# analbuminémia congénita
- Bisalbuminémia
#congénita
#drogas
#pancreatites agudas
```
37
Região alfa 1
- 90% alfa 1 antitripsina
- 10% - thyroid binding globulin, alfafetoproteina, alfa 1 glicoproteina acida, alfa1 lipoproteina- HDL
- sintese figado
- Aumentada
# inflamação aguda ou crónica
# neoplasias (ex: aum alfafeto por hepatocarcinoma)
# pós-trauma ou cirurgia
# gravidez ou estrogenioterapia
- DIminuida
# def em alfa 1 antitripsina (cirrose e enfisema)
# doença hepática (dim da prod)
38
Região alfa 2
- Haptoglobina, ceruloplasmina, alfa 2 macroglobulina
- sintese figado
- resposta um pouco mais tardia
- Aumentada
# prot de fase aguda (cerulo e hapto)
# aum da alfa 2 macro or sindrome nefrótico (associada a baixa alb)
- Diminuida
# baixa cerulo (d. wilson, ma nutrição, s. nefrotico, enteropatia com perda de proteina)
# baixa hapto (hepatopatias grave, anemia megalo ou hemolise, hemolise intravascular) - marcador mais sensivel da hemolise porque se liga a Hb apos hemolise
39
Região beta
- beta1 :transferrina, beta lipoproteina, outros fatores do complemento
- beta2: c3
- IgA, IgM e IgG podem tambem aparecer
- Aumentada
# aum da transferrina (anemia ferropénica, gravidez e terapia estrogénica)
# aum beta lipoproteina (hipercolesterolemia de tipo II, hipotiroidismo, cirrose biliar, sindrome nefrotico, DM)
# aum C3 (inflamação, HT maligna, D. cushing, carcinoma)
- DIminuida
- dim transferrina (inflamação aguda - diminui sintese hepatica, prot de fase aguda negativa)
- dim C3 (def genetica)
40
Região gamma
- inclui Igs (maioritariamente IgG)
- IgM e IgD migram proximo da região beta
- IgA migra entre a região beta e gamma (como a PCR)
- Aumentada
# sindromes
linfoplasmociticos
# hiperimunizações
# infeções agudas
# doença hepatica/inflamatória cronica
# neoplasia disseminada
- DIminuida
# idade
# deficiência congénita ou adquirida
# Tratamento imunossupressor (VIH, transplante,...)
41
Doença de Bruton
- falta tirosina-cinase de Bruton (enzima importante no desenvolvimento e diferenciaçãode linf B)
- a partir dos 6 meses quando já não há compensação de AC da mão ha agamaglobulinemia
42
Pico policlonal vs monoclonal
- pico policlonal o que
estamos a ver é essa variedade de proteínas representada, por estar aumentada. Se, por outro
lado, tivermos um pico fino, de base estreita como o da albumina, vamos ter o aumento de um só tipo de imunoglobulina, com as mesmas cadeias, a mesma especificidade. Este é um pico
monoclonal.
- Eu tenho provavelmente um
clone tumoral, ou seja, uma célula da linhagem B que está a secretar o seu anticorpo em excesso.
Está a proliferar e a ter uma sobreprodução desta proteína que vai ser excretada para o soro.
Mas como é que eu posso provar que aquele pico é de facto monoclonal? Para comprovar a monoclonalidade de um pico
de base estreita na eletroforese fazemos agora um ensaio de confirmação, que pode ser uma
imunoeletroforese ou uma imunofixação, que nos vai dizer qual é a cadeia leve e qual é a
cadeia pesada daquela amostra. Se ela tiver várias, não é monoclonal
43
Imunoeletroforese do soro
- amostra em paralelo com soro controlo normal
- também se pode fazer na urina
- são tipo espelho se tiver tudo normal
- lê-se de baixo para cima
- coloca-se anti-soros que são anticorpo contra Igs e cadeias levesentre o soro controlo e doente
44
Imunofixação
- Soro, urina, LCR
- gel de agarose
- faz-se eletroforese 6x para se colocar AC contra todas as Igs (IgG, A,M e cadeias leves) - tira de acetato de celulose com antisoro embebido--> precipitação de imunocomplexos com posterior coloração
- primeira linha são proteinas do soro com a albumina no topo
45
Proteínas de Bence jones
```
- São proteínas monoclonais ou
imunoglobulinas de cadeia leve
encontrado na urina, com um peso
molecular de 22 a 24 kDa. A
presença destas proteínas na urina
pode ser sugestiva de mieloma
múltiplo ou Macroglobulinemia
de Waldenstrom
- devido a sobrecarga renal
```
46
Imunofixação no LCR
- gamapatia, doença desmielinizante
- Imunofixação soro e depois LCR -- se estiver igual houve passagem e é provavel gamapatia, se houver prod intra-tecal --> esclerose multipla ou em infeção
- faz sentido mielograma no mieloma multiplo, e do ponto de vista da avaliação proteica imunofixação, eletroforese e doseamento de cadeias leves
47
hipogamaglobulinémia
Doença de Bruton, hipogamaglobulinemias transitoria de infância, defice CD40L (não ha classe switch)
48
Testes laboratoriais de gamapatias monoclonais
- Eletroforese de proteínas séricas
- Imunofixação/
Imunoeletroforese (soro, urina)
- Doseamento de imunoglobulinas
- Doseamento de cadeiras leves integrais (normalmente pela concentração de IgG,A,M)
- Doseamento de cadeias leves livres séricas (quando a Ig está formada a região detetada não esta exposta- não da para dosear) - as cadeias leves livres são filtradas pelo rim ao nivel do glumerulo e reabs nos tubulos renais (filtração de monomeros K (eliminação 2-4h) é 3x mais rapida que dimeros lambda(eliminação 3-6h)) - soro contem razão K: lambda 0,625
- Se tenho rim com
lesão e começo a
perder proteínas indiscriminadamente, a
razão de cadeias k/lambda na
urina está mantida. Se o aumento
de proteína estiver associado
sobretudo a um aumento k ou lambda é indício
de gamapatia monoclonal
49
Razão K:lambda Igs policlonais
1,5 a 2:1
50
Aumento serico de CLL monoclonais
MM, Mieloma CLL, amiloidose, doença deposição cadeias leves
51
Citometria de fluxo
- A citometria de fluxo é um equipamento que tem 3 sistemas que
permitem a caracterização
individualizada de cada célula que os
atravessa:
- Sistema de fluidos
- Sistema Ótico
- Sistema Eletrónico
- No sistema de fluidos, a amostra vai
ser aspirada e os fluidos vão empurrar
e pressurizar as células, de forma a
que fiquem todas em “fila indiana”
uma a uma, para passarem em frente
à câmara, onde vão entrar em
contacto com 2 lasers. Quando a
célula passa, surgem interrupções no feixe do laser
- A 180 graus vamos ter noção do tamanho da célula em função da “barra de escurecimento” –
forward scatter. A 90 graus vamos ter o side scatter, correspondendo à complexidade (ou
seja, se a luz bate na célula e é refletida a 90 graus). Por exemplo se passar um linfócito têm se
muita luz a atravessar pois este não é complexo, se for um eosinófilo, como há muitos grânulos,
chega menos luz ao detetor pois esta é refletida. Num hemograma, surge uma contagem
diferencial das diversas populações; com estes dois scatters é possível obter logo estes
resultados
- só da para fluidos e se quisermos biopsia temos que liquidificar
- utiliza fluorescência (detetada atraves do sistema otico) - Por exemplo, se se marcar o CD3 com um anticorpo monoclonal
fluorescente verde anti CD3, os linfócitos T aparecem verdes; se marcar CD19 a vermelho, os
linfócitos B emitem luz vermelha. Assim, à medida que as células passam à frente do laser
percebe-se qual a fluorescência que emitem, o que dará origem aos seguintes gráficos (dot plot)
geridos pelo sistema eletrónico do citómetro:
52
Citometria fluxo marcadores
- CD3 e CD4
- CD3 e CD8
- CD19
- CD16 (recetor baixa afinidade para IgG) e 56
- CD45 para todos leucócitos
53
Citometria fluxo contagem subpopulações
- Temos de colocar as
células do sangue com anticorpos
monoclonais e lisar os
eritrócitos, se não só
haveria eritrócitos e
não leucócitos na
análise direta no
citómetro
- Há doentes que fazem a cada 2/3 meses para avaliar a contagem dos CD4 não só para o
diagnóstico e prognostico, mas também para monitorização da terapêutica e estabelecimento da
imunodeficiência primaria. No contexto dos VIH, devemos verificar os CD4, perceber como está
a função imune dos doentes. Não só no diagnóstico de Sida, mas até na monitorização
terapêutica dos doentes, a contagem dos CD4 é crucial.
54
Aplicaçoes clinicas da citometria fluxo
- estudo e caracterização de imunodef
- VIH/SIDA - valor abs cd4 (prognostico, profilaxia, terapeutica, diagnostico)
- estudo e caracterização autoimunes
- despiste leucemias/ linfomas
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Razão CD4/CD8 normal
2
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Cel CD4 ara sida
abaixo 200 cel/microlitro
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Particularidade de Razão neutrofilo/linfocito
está invertida nas crianças ha mais linfocitos
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Linfopenia T em crianças
- bebé não tenha timo,
(situação rara mas muito grave), síndrome de DiGeorge, ou uma SCID (Severed combined immune deficiency). Este bebé não pode receber vacinas vivas, nem transfusões, e são
necessários vários outros cuidados. É proposto para transplante
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Estudo fagocitose
-dermos
bactérias
fluorescentes aos neutrófilos conseguimos verificar se eles
são ou não capazes de fagocitar. De seguida põem-se as
células a 37ºC, depois passam-se as células pelo laser, se
emitir luz é porque fagocitou as bactérias.
(A 0ºC não acontece fagocitose) - se ganham fluorescência fagocitaram
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Estudo do burst oxidativo
- A NADPH oxidase produz radicais livres de O2,
peróxido e óxido nítrico, podendo também atuar
noutros substratos como a dihidrorodamina 123.
Se o burst oxidativo se encontrar normal esta é
degradada num produto
fluorescente, a
RODAMINA123. Pegamos nos neutrófilos e vemos
como estão em repouso e quando recebem
estímulo e comparamos os resultados. O estímulo
chama-se PMA neste caso, e vemos esta janela
traçada é a janela de neutrófilos, tamanho e
complexidade. Quando se dá dihidrorodamina, no
estado basal, os neutrófilos não fazem nada, por outro lado, quando se dá a PMA, (o estimulo
real), “saltam” e emitem fluorescência o que significa que degradaram a dihidrorodamina e estão
funcionais. Fazendo a razão de fluorescência do grupo em estado basal e do grupo que recebeu
o estimulo obtém-se o índice oxidativo normal – NOI (normal oxidative index)- que deve ser
sempre superior a 30
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Doença granulomatosa crónica
- doentes apresentam-se com abcessos de
repetição muito cedo
e complicações
ligadas à dificuldade
em eliminar o patogéneo- NOI a baixo do normal
- forma def da NADPH oxidase
- ligada ao cromossoma X (cada neutrófilo escolhe qual cromossoma X
quer ativar, uns ativam o X doente e outros
o normal - 2 populações de neutrófilos - as vezes temos 2 NOI)
- Há a possibilidade de ter as formas autossómicas
não ligadas aos cromossomas sexuais. (Raro)
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Fagocitose diminuida
```
- def neutrofilo:
# associada a alt complemento (Ex: c3bi)
# associada a baixa Ig
# trauma, DM, falha renal
# SIDA
```
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fagocitose aumentada
- imunomodeladores (IL-2, IFN gamma, Ácido lático)
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Alt metabolismo oxidativo
- Doença granulomatosa crónica
| - Transplante, SIDA e idade (metabolismo oxidativo dim)
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Avaliação função/proliferação linfócitos
- PBMCs - mononucleares- linfócitos e monócitos ( Estes mononucleados têm uma menor densidade, assim
se pusermos o sangue a centrifugar com uma substância que tenha
uma densidade entre
os polimorfonuceados
e os mononucleados "Ficoli", vão ficar separados.
- Muitas vezes faz-se esta avaliação colocando as células em cultura e vendo se proliferam.
Normalmente estas células proliferam se tiverem estimulo, depois de aplicar o estímulo, damos
um composto radioativo. Se ficarem todas cheias de radioatividade, dividiram e integraram o
nucleótido radioativo. O resultado é avaliado por um computador que analisa o índice células
estimuladas e não estimuladas
- Hoje em dia é possível fazer isto sem
radioatividade, administra-se nas células
um corante fluorescente e com a divisão
este vai
repartindo o corante em
quantidade igual pelas células filhas. Se o
corante começar a desvanecer e diminuir
de intensidade é porque
houve proliferação
- indice de estimulação (SI)= cel estimuladas/ cel não estimuladas
- Útil por
exemplo numa criança ainda com SCID visto que há defeito ligado aos linfócitos, desde a
produção de citocinas à função citotóxica e à capacidade de proliferação..
