ADN y PCR 1.1

Question 1

Es el primer paso para los estudios de biología molecular y para las técnicas de DNA recombinante, secuenciación, mutagénesis:

Answer 1

extracción de ADN y ácidos nucleicos

Question 2

¿De qué depende el método de extracción de ADN para el análisis de ácidos nucleicos?

Answer 2

• tipo de ácidos nucleicos que se extraerá (ssADN, sdADN, ARN, ARNm, ARNr)
• organismo de origen (procariota, virus, etc)
• fuente del ácido nucleico (sangre, orina, etc)
• técnica a utilizar

Question 3

¿Qué hace el cloruro de amonio?

Answer 3

disuelve/rompe membranas

Question 4

¿Qué hace el SDS?

Answer 4

rompe membranas

detergente (las que no se rompen con el c. de amonio se rompen con esta)

Question 5

Secuencia de elementos y fases (arriba-abajo) al observar los tubos para el análisis de acidos nucleicos

Answer 5

1. ADN (fase acuosa)
2. proteinas (fase organica)
3. fenolcloroformo (fenol)

Question 6

¿Qué pasa en la lisis de las células y liberación de ADN en el análisis de ácidos nucleicos?

Answer 6

• lisis de eritrocitos: con cloruro de amonio
• lisis de membranas celulares y nucleares: con SDS (dodecilsulfato sódico)

Question 7

Elementos en la precipitación de ADN para el análisis de ácidos nucleicos

Answer 7

• solución salina salturada
• etanol 100%

Question 8

Elementos para el lavado del ADN el análisis de ácidos nucleicos

Answer 8

• etanol 70%
• agua

Question 9

Extracción de ADN por perlas

Answer 9

en vez de papel filtro hay perlas (pelotitas) que atraen al ADN y hacen el papel de ese filtro

Question 10

¿Qué hace el espectrofotómetro?

Answer 10

• permite el paso de un haz de luz a través de la solución inversamente a la cantidad de moleculas
• manda una longitud de onda
• + luz absorbida + concentracion

Question 11

Cantidad de absorción de proteínas, ADN y fenol en el análisis de ácidos nucleicos

Answer 11

• DNA y RNA absorción: 260nm
• proteinas: 280nm
• fenol: 270 nm

Question 12

¿Qué es la fluorometria?

Answer 12

• cuantifica la cadena de ADN
• SOLO es para ADN
• absorbe luz y emite longitud de onda superior
• se unen colorantes fluorescentes al ácido nucleico
• concentración es proporcional a la emisión fluorescente

Question 13

¿Qué requiere la PCR?

Answer 13

• secuencia de ADN (experimento)
• enzima ADN polimerasa (taq)
• desoxirribonucleicos (dNTP)
• primers

Question 14

¿Qué es la ADN polimerasa?

Answer 14

enzima que polimeriza una cadena de DNA tomando como molde una preexistente

Question 15

Características del ADN polimersa para la PCR

Answer 15

• soporta 95°
• se le llama “ADN polimerasa Taq” por la bacteria thermus aquaticus
• tiene que tener amortiguadores
• pH de 8.4
• tiene que tener desoxirribonucleotidos (adenina, citosina, guanina y timnina) para que inicie la nueva cadena

Question 16

Características de los iniciadores/primers/cebadores en la PCR

Answer 16

• específicos para un gen (SARS-COV2)
• dan extremo 3’
• muchas C y G (3 puentes de H)
• continua 5’ 3’ y rezagada 3’ 5’
• reconocen secuencias blanco

Question 17

Temperaturas y etapas del termociclador en el análisis de ácidos nucleicos

Answer 17

• desnaturalización
  → separa cadenas de ADN
  → 95°
• hibridación/alineamiento
  → primers alineados al ADN (3’)
  → 50° a 60° (tm)
• extensión
  → taq polimerasa pone nucleótidos (dNTP’s)
  → 72°

Question 18

Temperatura a la que la taq polimerasa hace su función

Answer 18

72°

Question 19

¿Cuántos ciclos tiene la PCR?

Answer 19

35 ciclos
cada ciclo da 2 ADN´s

amplifica la presencia de 1 segmento