7. Métodos de Deteção Flashcards
1.
Em que diferem os métodos de identificação e deteção?
Identificação: determinação da identidade de uma cultura pura; não existem protocolos definidos
Deteção: avaliação da presença de um MO/toxina na comida, sem necessitar de isolamento.
Quais os problemas na deteção de MOs?
- complexidade molécular
- complexidade populacional dos MOs
- distribuição não uniforme dos MOs
- Viabilidade de MOs patogénicos (solução: indicadores)
Soluções para os problemas da deteção de MOs em amostras alimentares são a utilização de:
- Meios de enriquecimento
- Meios seletivos
- Meios diferenciais
Em que consistem os meios de enriquecimento e como pode ser usado?
Favorece o crescimento de determinado grupos de MOs
* Pré-enriquecimento: recuperação da viabilidade celular
* Enriquecimento em meio seletivo: diminui competição no microbioma natural.
* Pós-enriquecimento: aumenta os conteúdos bacterianos
O que é um meio seletivo?
Permite o crescimento de uns MOs e a inibição de outros
O que é um meio diferencial e em que consiste a identificação dos MOs neste meio?
Meio que diferencia MOs ou grupos de MOs através do metabolismo diferente de determinados compostos
Os meios podem ser seletivos e diferenciais?
Sim
A cultura de MOs em meios seletivos e/ou diferenciais é um teste…
Presuntivo: não há certeza absoluta; não há identificação mas sim deteção
A confirmação da identidade do patogénio só é feita após testes…
Comparativamente aos testes de deteção, são mais acessiveis?
bioquímicos ou serológicos
Não. São caros, complexos e time consuming
Os testes bioquímicos implicam a deteção de … enquanto que os serológicos a deteção faz-se por…
- metabolitos consumidos e/ou usados
- antigénios produzidos
Dentro dos métodos diretos de deteção temos:
Só é aplicado a MOs…
- riscado à superfície
- sementeira à superfície
- sementeira por incorporação
- dupla camada
- filtração por membrana
viáveis
A técnica de dupla camada é usada para quantificar … . Consiste numa primeira camada, o … … e uma segunda camada de agar … .
Para que serve a segunda camada?
- vírus
- suporte nutritivo
- soft
permite mobilidade dos fagos para infetarem bactérias presentes no soft agar; a primeira camada serve de suporte físico e nutritivo ao meio
A cultura de vírus entéricos faz-se em …
Culturas de tecidos
Todos os vírus apresentam linhas celulares compatíveis ao seu cultivo? Se não, podem ser detetados à mesma?
Não. Desta forma não se podem detetar.
Como se chama o efeito causado pelos vírus nas linhas celulares que permitem a sua deteção?
Efeito citopático
Dentro dos métodos indiretos de deteção temos:
Como os diretos, também só é aplicado a MOs…
métodos baseados em estatística
* most probable/ likely number
Viáveis
Na técnica de filtração por membrana, estas são colocadas em meio …
Seletivo/diferencial?
Diferencial
A observação de culturas ao MO ótico constitui uma técnica … para MOS …
Direta/indireta
- direta
- viáveis, não viáveis e mortos
O que são MOs não viáveis?
MOs que** não crescem em meio de cultura** mas têm a capacidade de infetar e multiplicar
Em que se baseiam os testes bioquimicos?
- Atividade enzimática
- Uso de fontes de carbono
- uso fermentativo de carbohidratos
- Sistema de transporte de eletrões
- produção de metabolitos específicos
Os testes bioquímicos são realizados quando os MOs já foram sujeitos a um meio …
Diferencial.
Conseguimos destinguir um MO que faça respiração de um que faça a fermentação através da produção de … deste último
ácidos (lático, propiónico…)
Teste do indole
Indole é um componente do …
Algumas bactérias degradam … com a produção de …
Na presença de … o reagente de Kovac é …; um teste negativo tem cor …
- triptofano
- triptofanos
- indole
- indole
- rosa
- amarela
Vermelho de metilo
Deteta a produção de … … a partir da fermentação mista de …
Usado para diferenciar …
O vermelho de metilo a pH baixo é … e a pH alto …, ou seja, um teste positivo é de cor …
- ácidos estáveis
- glucose
- entereobactericeae
- vermelho
- amarelo
- vermelha
Num tubo que seja o nosso controlo, todo o procedimento para este é feito de forma … exceto a ….; Por isso, um teste negativo em vermelho de metilo apresenta-se turvo e … uma vez que …
igual … inoculação
amarelo… houve crescimento de MOs mas não produção de ácidos
o branco nunca tem o analito/MO a determinar
Teste Voges Proskauer (VP)
Deteta produção de … produzida pela fermentação … da glucose
Diferencia …
Testes positivos são de cor…
- acetoína
- butanediólica
- entereobacteriaceae
- vermelha
Fermentação dos carbohidratos
Determina a habilidade de fermentar … …
Usado para detetar Gram …
O vermelho de … é usado, assim como um tubo de Durham para recolher …
Durante a fermentação as bactérias convertem glucose em … com a produção ou não de …
- açúcares simples (glucose, frutose, lactose, …)
- negativas
- fenol
- gás
- ácidos orgâncos
- gás
Fermentação dos carbohidratos
Um teste positivo para a formação de ácidos orgânicos é de cor … sendo positivo para a formação de gás se …
Como se chama o inidicador usado?
- amarela
- se o tubo de Durham tiver gás
Vermelho de fenol
Vermelho de metilo Vs. fenol
A pH < 4,5 o vermelho de metilo é … e o de fenol …
- vermelho
- amarelo
Metabolismo da glucose
Organismos … usam glucose com a produção de ácido em condições … e …
Organismos … usam glucose em condições …
Em meio H&L, testes com resultado oxidativo apresentam cor … e testes com resultado fermentativo cor …
- fermentativos … aeróbicas … anaeróbicas
- oxidativos … aeróbicas
- tubo com cera a verde e tubo destapado a amarelo -> produção de ácidos só no tubo destapado
- tubo com cera amarelo e tubo destapado amarelo -> produção de ácidos em ambos os tubos
Neste teste a concentração de glucose é elevada para que haja produção de ácidos tanto na via oxidativa como na fermentativa através de glucose. Apenas se dá produção de ácidos no tubo destapado em oxidativos pois são obrigados a usar a via aeróbia.
Uso de citrato
Deteção da atividade da enzima … que permite os MOs usarem … como fonte de …
O meio de … tem … como fonte de … para além da fonte de carbono
É usado o indicador … … que vira verde a pH … e azul a pH …
Um teste positivo é de cor … uma vez que com o consumo de citrato o pH …
- citrase … citrato … fonte de carbono
- Simmons … amónia…nitrogénio
- Azul de bromotimol… neutro… superior a 7,6
- azul … sobe
Hidrólise de amido
Deteção das enzimas … e …
Usa-se o indicador … para visualizar o amido na cultura uma vez que na presença de … torna-se de cor …
- amilase e oligo 1,6-glucosidade
- Iodeto… amido…preto/escuro
Hidrólise da caseína
Na presença de … a caseína é hidrolisada formando … à volta das culturas
É usado agar de … nas culturas
- caseinase … aurélas
- leite
Hidrólise de ureia
O teste é feito em … e é usado … como indicador. Na presença de amónia o meio fica de cor … indicando …
- anaerobiose … vermelho de fenol
- vermelha (pH sobe) … hidrólise da ureia
Teste da coagulase
Usada para diferenciar … de … .
A enzima responsável é a … e transforma … (solúvel) em … (insolúvel)
Um teste negativo só o é considerado caso…
- potenciais S. aureus patogénicas … gram positivas
- fibrogénio … fibrina
- não haja formação de coágulo 24h após inoculação
Redução do nitrato
Redução do nitrato a … causa mudança de cor no meio para …
Se o nitrato for reduzido a … ou … o que acontece à mudança de cor? Como se procede a seguir?
O teste é feito em condições aeróbicas ou anaeróbicas?
- nitrito … vermelho
- amónia ou nitrogénio -> não há mudança de cor; adicionar pó de zinco para testar se houve redução completa ou se o teste é negativo (não se dá a redução do nitrato)
Anaeróbicas
Produção de sulfureto
Usa-se um meio … e testa-se a capacidade de um MO em:
É muito usado para diferenciar membros do grupo das …
Diferencial
1. reduzir enxofre
2. produzir indole
3. mobilidade
Enterobacteriaceae
Produção de sulfureto
Se houver redução do sulfureto a sulfeto de hidrogénio o meio fica …
Se houver produção de indol através do triptofano, o topo fica…
Se houver mobilidade, o meio fica …
- negro
- rosa
- turvo
Triple Sugar Iron
Diferencia as bactérias pela sua habilidade em … e …
É considerado um teste presuntivo? Porquê?
Que indicador é usado?
Como se pode distinguir um teste positivo de um negativo a todas as características?
- fermentar glucose, lactose e/ou sacarose … reduzir enxofre
- Permite afunilar os candidatos bacterianos sem os identificar
- Vermelho de fenol
- Quando um dos açúcares é fermentado o meio fica amarelo (baixo pH); se ocorreu alcalinização das peptonas o meio fica vermelho escuro
- tiosulfato de sódio pode ser reduzido a sulfeto de hidrogénio que reage com** iões de ferro do meio** formando sulfeto de ferro, criando um precipitado preto insolúvel
Quantos resultados pode ter o triple sugar iron?
10
Os testes bioquímicos rápidos são baseados em que técnicas?
Que características têm estes testes?
- microbiológicas
- químicas
- bioquímicas
- biofísicas
- imunológicas
- genéticas
Capacidade de destinguir, enumerar, caracterizar e identificar MOs e produtos
Os testes bioquímicos rápidos têm a vantagem de:
Eles têm de ser … e … para detetar baixas concentrações.
- serem mais rápidos que os tradicionais
- eliminam os vários passos dos tradicionais
sensíveis e específicos
Os pontos críticos na aplicação de métodos rápidos são:
- enriquecimento da amostra
- confirmação
- Intreferência
- alvo único
- Disponibilidade de kits comerciais
- Impacto na regulação
O ponto crítico “enriquecimento da amostra” baseia-se em quê?
- em amostras de comida (matriz amostral complexa)-> métodos rápidos -> baixa sensibilidade e especificidade
- enriquecimento -> dilui inibidores que intreferem com a viabilidade de patogénios
Não se usa meio de pré enriquecimento pois implica mais trabalho e tempo
O ponto crítico “confirmação” baseia-se em quê?
- Um positivo num teste rápido é presuntivo! -> tem de ser confirmado por métodos clássicos
Apesar do passo da confirmação de testes positivos demorar algum tempo, porquê não é considerado um passo … ?
limitante
* existe uma taxa de negativos muito superior aos positivos presuntivos
O ponto crítico “intreferência” baseia-se em quê?
- alguns métodos demonstram melhor performance que outros devido a: a) intreferencia com a flora nativa; b) intreferência com a matriz amostral
- métodos rápidos devem ser escolhidos conforme a comida
- estudos comparativos devemser feitos entre testes
O ponto crítico “alvo único” baseia-se em quê?
- testes rápidos são dirigidos a uma único alvo (MO/toxina)
- regulamentos requerem identificação de vários MOs-> neste caso a utilização de vários testes rápidos pode ser caro e complexo
O ponto crítico “disponibilidade de kits comerciais” baseia-se em quê?
- grande variabilidade de kits comerciais -> difícil escolher o melhor para determinada análise + calibração de resultados
O ponto crítico “impacto na regulação” baseia-se em quê?
- antes de se usarem os kits -> têm de ser calibrados e validados
- não há mecanismos para controlo de falsos negativos -> apenas os positivos é que são confirmados
A validação de novos métodos rápidos é verificada e legalmente aceite por …
Entidades internacionais
AOAC, ISO, AFNOR, IDF, Codex Alimentarius
Os métodos bioquímicos rápidos podem ser…
(exemplos de testes)
- redução redox por corante
- Kits de deteção bioquímicos mini
- modificações a métodos bioquímicos convencionais
- métodos baseados em anticorpos
- métodos bioluminescentes
- métodos baseados em mudança das propriedades elétricas do meio de cultura
- baseados em análise de ácidos nucléicos
O método rápido de redução de corantes é usado na indústria do … baseando-se na avaliação … usualmente utilizando … ou …
Como é feita a deteção com resazurina? E com azul de metileno?
- do leite
- colorimétrica
- azul de metileno
- resazurina
Resazurina: azul; na presença de MO é reduzida a composto roxo, rosa até incolor. (depende da cor)
Azul de metileno: azul; se for reduzido a composto incolor rapidamente o leite é “mau”. (depende do tempo)
O teste rápido da catalase dá resultados positivos e negativos para esta enzima. Ambos os MOs são importantes em microbiologia alimentar?
A catalase também é usada para monitorizar:
Sim
limpeza em áreas alimentares e pasteurização
O teste rápido da oxidase utiliza um dador de eletrões artificial para reduzir a enzima. Se esta estiver presente forma-se um complexo …
Violeta
Os mini testes bioquímicos rápidos só podem ser aplicados a … crecidas em meio … ou ….
Estes testes consistem numa bateria de testes … e …
São usados para identificar…
- colónias puras
- seletivo
- não seletivo
- bioquímicos
- enzimáticos
grupos definidos de MO
Como podes descrever o teste rápido Biolog/Odin?
- Identifica rapidamente e com exatidão 3000 espécies de bactérias e fungos
- caracteriza metabolismo celular, cinéticas de crescimento e identifica
As minigalerias Vitek têm a vantagem de serem…
Pode ser acopulada…
completamente automatizadas (inoculação, monitorização de resultados e perfil bioquímico)
Espetrofotometria de massa
Os 3M Petrifilm Plates vêm com meio …, por isso não necessitam de …
- meio diferencial
- preparação do meio de cultura
Os testes bioquímicos também podem ser modificações de métodos tradicionais, como sementeiras modificadas pelo método em … .
Deste modo, a amostra é espalhada na superfície de uma Petri de modo a que haja um …
O resultado é determinado …
espiral
gradiente de concentração que decresce do centro para a periferia
estatisticamente
ISO e NEO grid são sistemas de … usados para …, … e … de microrganismos
Combinados com meio de crescimento, permitem a contagem de …
Filtração
deteção, confirmação e enumeração
bactérias e grupos bacterianos específicos
Testes bioquímicos em que o meio de cultura é suplementado podem ser do tipo … .
Detetam a … fornecendo testes …
- cromogénico
- atividade enzimática
- presuntivos
O meio de MacConkey contém … que fica rosa na presença de … resultantes da fermentação da … .
Este meio é … e …pois inibe Gram + e fica rosa na presença de ácidos.
O meio EMB apenas distingue …
- indicador de pH
- ácidos
- lactose
- seletivo … diferencial
MOs que fermentam lactose dos que não
Técnicas de bioluminescência são dos mais … e … na … de MOs.
Estas técnicas podem ser baseadas em 2 categorias:
Existem mais testes diponíveis para…
ATP é baseada na reação que ocorre naturalmente em… através da enzima…
rápidos e sensíveis … deteção
1. Bioluminescência ATP
2. Bioluminescência bacteriana
* ATP que bacteriana (foram desenvolvidos depois)
pirilampos… luciferase
Na bioluminescência por ATP, 1 molécula de ATP origina … de luz. Assim, instrumentalmente, é possível medir níveis … de energia
Luciferina e Luciferase são, respetivamente:
1 fotão
níveis baixos
Substrato e Enzima
É possível produzir luciferase a partir de:
E. coli recombinante
Quando se usa a técnica de ATP para detetar MOs, o que se deve fazer à bioluminescência ATP não microbiana?
Destruir ou separar
Para além da deteção de MOs, a bioluminescência ATP pode ser usada para avaliar a eficiencia de … detetando também …
Para haver deteção dos MOs tem de se dar a rotura das células?
higiene e limpeza de superfícies … restos de comida
Sim, para haver libertação do ATP das células e este juntar-se ao sinal do ATP dos alimentos
Para avaliar a qualidade microbiológia de materias primas através de bioluminescência ATP é necessário:
Esta técnica é muito utilizada para testar a qualidade de…
remover bioluminescência ATP não microbiológica através de apirase
leite
A bioluminescência ATP pode ser usada para detetar enzimas?
Sim, proteases bacterianas em leite
Reduzindo a quantidade de luciferase é possível determinar o conteúdo de MOs presentes (quantidade de MOs inversamente proporcional à quantidade de luz)
Como se pode separar ATP microbiano de não microbiano?
Centrifugação, filtração, tratamento com resinas
A bioluminescência ATP pode ser usada para avaliar a atividade das culturas starter?
Sim, por deteção da redução do nível de ATP intercelular uma vez que as culturas starter produzem compostos que inibem o crescimento de outros MOs
Em que difere a bioluminescência dos pirilampos para a bacterian?
Bacteriana: energia através de mononucleótido reduzido de flavina e como substrato um aldeído.
P
Como se chamam os genes envolvidos na bioluminescência bacteriana?
lux
Como se usa a bioluminescência bacteriana para identificar MOs e indicadores?
- fagos como vetores para inserir genes lux
- quando bactérias são infetadas expressam gene lux
Como são detetadas substâncias inibitórias usando a bioluminescência bacteriana?
- Bioluminescência está relacionada com o metabolismo bacteriano
- compostos que inibam a atividade bacteriana decrescem produção de luz
Os testes imunológicos são … e … e detetam um nº elevado/baixo de MOs na amostra.
Rápidos e exatos…. elevado
Qual o princípio dos testes imonulógicos?
Interação antigénio-anticorpo.
O que é um antigénio?
Antigénio: substância capaz de induzir a produção de anticorpos
* Proteínas/carbohidratos de alto peso molecular que são reconhecidas como “corpos estranhos”
O reconhecimento de … é feito pelos …
antigénios … anticorpos
Que componentes celulares conseguem os anticorpos detetar?
- componentes dos flagelos
- antigénios da parede celular
- polissacarídeos da membrana
- polipéptidos/toxinas
Existem muitos testes imonulógicos?
Sim
ELISA, aglutinação proteínas,…
A ELISA é um teste antigo/recente. São usadas culturas …
- antigo
- enriquecidas
Os testes ELISA podem ser colorimétricos e …
fluorogénicos
Os testes ELISA podem ser de 3 tipos:
- Indiretos: antigénio + anticorpo + enzima + susbtrato = sinal
- sandwich: anticorpo + antigénio + anticorpo e enzima + substrato = sinal
- competitivo: anticorpo com antigénio + antigénio onde se ligará apenas o anticorpo específico + anticorpo com enzima + substrato = sinal
Uma grande vantagem dos ELISA é que podem ser …
automatizados
Os sistemas VIDA dão resultados colorimétricos ou fluorescentes?
fluorescentes
Qual a vantagem principal da separação imunomagnética?
- Capacidade de isolamento do patogénio –> capacidade de o quantificar
Os ELISA apenas dão resultados qualitativos
A separação imunomagnética utiliza por partículas paramagnéticas revestidas por …
anticorpos
A seguir a uma separação imunomagnética, pode ser usado um teste … para…
ELISA…identificar os organismos alvo
A separação imunomagnética necessita de corantes e reações metabólicas?
Quais as vantagens?
Não
Quando um MO não está metabolicamente ativa pode não converter os corantes ou indicadores em produtos detetáveis/quantificáveis
O teste ELISA é mais/menos sensível que o imunomagnético.
Menos, o teste imunomagnético é mais sensível.
A citometria de fluxo é uma técnica qualitativa/quantitativa.
Quantitativa
A citometria de fluxo consegue detetar MOs de uma estirpe em específico? Porquê?
Sim, utilizando sondas específicas a essas estirpes
Do mesmo modo, identifica cell viáveis de não viáveis.
A citometria de fluxo consegue determinar a concentração de MOs?
Sim
O sucesso dos métodos moleculares deve-se ao facto dos … serem …
- ácidos nucleicos
- facilmente isolados, visualisados e quantificados; apresentarem uma sequencia única dependendo do organismo
- Poderem ser amplificados!!!
O método molecular PCR, consiste em quais passos?
- Desnaturar cadeias duplas
- annealing dos primers
- extensão
O que é necessário para a técnica PCR?
- nucleótidos livres
- polimerase
- primers
- sequencia a ser amplificada
- buffer
Qual a maior vantagem da qPCR em relação à PCR?
**Quantificação inicial **da moléc. de interesse
Em qPCR qual é a sonda mais específica?
TaqMan
O sinal da qPCR pode ser monitorizado … por isso a técnica é designada por “real time PCR”
durante toda a atividade
A sonda Taqman depende da atividade … da polimerase e permite aumentar a especificidade uma vez que…
exonucleotidica 5’->3’
são específicos para determinadas zonas do DNA
Polimerase degrada quencher e dá-se emisão de fluorescência
Taqman só se liga à cadeia … do DNA
Complementar
