4.3 Détermination structure primaire des peptides et protéines

Question 1

L’enchaînement de résidus dans un peptide forme ?

Answer 1

la structure primaire d’une protéine

Question 2

Lorsqu’on a obtenu une solution relativement ? et de ? suffisamment élevée de notre protéine d’intérêt, on peut déterminer ? en ? étapes via une technique connue comme ?

Answer 2

pure
concentration
la structure primaire 
8
la dégradation d'Edman

Question 3

Quelles sont les 8 étapes de la dégradation d’Edman?

Answer 3

1. Bris des ponts disulfures
2. Bris des interactions non covalentes
3. Composition en acides aminés
4. Caractérisation des extrémités N- et C- terminales
5. Fragmentation des chaînes polypeptidiques
6. Séquençage des fragments
7. Reconstruction de la séquence
8. Localisation des ponts disulfures

Question 4

Étape 1 =

Answer 4

Bris des ponts disulfures
À l’aide d’un agent réducteur comme le B-mercaptoéthanol
Pour empêcher les ponts de se reformer, on traite la protéine avec un agent d’alkylation comme l’iodoacétate, qui bloque les groupements -SH

Question 5

Étape 2 =

Answer 5

Bris des interactions non covalentes
Par chaleur, détergent (SDS) ou agent chaotropique (urée)
Chaque chaîne doit ensuite être purifiée par HPLC ou électrophorèse (permet analyse indépendante des chaînes)

Question 6

Étape 3 =

Answer 6

Composition de la protéine
Hydrolyse acide des liens peptidiques (conditions extrêmes, pH très acide et température élevée) afin de briser tous les liens peptidiques et ensuite analyser les résidus libérés
Formation de PTC-acides aminés (traitement au PITC = réactif d’Edman)
Analyse par HPLC
**Certains acides aminés sont partiellement détruits par hydrolyse donc B = Asx = Asp et Asn + Z = Glx = Glu et Gln **GROUPS AMINES DE ASP ET GLN

Question 7

Étape 4 =

Answer 7

Caractérisation des extrémités
Extrémité N-terminale = réaction du peptide avec le PITC, libération du résidu en N-terminal, analyse par HPLC
Extrémité C-terminale = libération du résidu en C-terminal (utilisation carboxypeptidase), réaction du résidu libéré avec le PITC, analyse par HPLC
**CARBOXYPEPTIDASE LIBÈRE DERNIER ACIDE AM

Question 8

Étape 5 =

Answer 8

Fragmentation des chaînes
Méthodes enzymatiques ou chimiques
Endopeptidases coupent les liens peptidiques à l’intérieur de la chaîne (obtenir de plus petits fragments)

Question 9

Étape 6 =

Answer 9

Séquençage des fragments
2 méthodes :
- Dégradation d’Edman : sépare fragments par HPLC avant analyse (analyses successives du résidu N-terminal) **PITC et F3CCOOH : LIBÈRE 1er ACIDE AM
- Spectrométrie de masse : pas de séparation préalable, de plus en plus utilisée car plus précise et sensible

Question 10

Avant étape 7 =

Answer 10

Répétition des étapes 5 et 6 donc fragmentation avec une 2e méthode et séquençage des fragments résultants

Question 11

Étape 7 =

Answer 11

Reconstruction de la séquence
Avec au moins 2 séries de fragments différents, les chevauchements entre les fragments permettent de déterminer la séquence de la chaîne entière de départ

Question 12

Étape 8 (étape indépendante) =

Answer 12

Localisation des ponts disulfures (donne de l’info sur structure tridimensionnelle)
1- Bris des interactions non covalentes
2- Bris des ponts disulfure sur une partie de l’échantillon et l’autre reste comme elle était
3- Fragmentation des 2 échantillons
4- Masse des fragments sont comparés par SDS-PAGE ou spectrométrie de masse MS/MS (suite à un traitement avec agent réducteur, changement de masse d’un fragment indique la présence d’un pont disulfure)

Question 13

MS/MS =

Answer 13

Spectrométrie de masse en tandem
2 spectromètres de masse séparés par une cellule de collision. D’abord, les fragments peptidiques sont vaporisés par ESI ou par MALDI ; ils passent ensuite dans un premier spectromètre qui nous donne leur ratio masse/charge. Un par un, les fragments sont dirigés vers une cellule de collision ou des molécules de gaz inerte viennent les fragmenter en plus petites molécules. Tous ces produits passent par un 2e spectromètre ou leurs masses sont déterminées.

Question 14

Comparaison des masses obtenues avec masses théoriques dans des bases de données (spectrométrie de masse) par =

Answer 14

Empreinte de masse peptidique
**Méthode de choix, plus sensible et moins d’étapes… Remplace dégradation d’Edman comme méthode principale de détermination de la structure primaire des prots

Question 15

Lorsqu’on utilise spectrométrie de masse et empreinte de masse peptidique pour obtenir séquence d’une protéine, les chaînes polypeptidiques ainsi que les fragments n’ont pas besoin d’être ? avant l’analyse

Answer 15

séparés

Question 16

Une chaîne de 60 000 Da contient environ ? de résidus

Answer 16

545

Question 17

Agent d’alkylation réagissant avec les résidus Cys =

Réactif utilisé pour l’identification de l’extrémité N-terminale =

Agent réducteur qui coupe des ponts disulfures =

Réactif utilisé pour couper les polypeptides en petits fragments =

Answer 17

Idioacétate
Phénylisothiocyanate (PITC)
2-mercaptoéthanol
Endopeptidase