4.1 Purification des protéines et 4.2 techniques d'analyse Flashcards
Première étape afin de purifier une protéine =
Ensuite, cet extrait devra être soumis à plusieurs ?
Préparation de l’extrait cellulaire
méthodes de séparation successives (précipitation, chromatographie)
Les ? et le nombre ? de purification sont variables d’une protéine à l’autre et dépendent ? de la protéine d’intérêt.
méthodes
d’étapes
des propriétés physico-chimiques
Comment se déroule la préparation d’un extrait de protéines? (2)
Qu’obtient-on à la fin?
1 - Libération du contenu cellulaire en brisant membrane : extrait cellulaire brut
2 - Centrifugation différentielle : différentes vitesses et temps de centrifugation + séparation des différentes particules pour éliminer résidus des membranes et organites
Un mélange de protéines solubles
On va purifier sélectivement selon:
- Solubilité
- Charge
- Taille
- Affinité
La solubilité dépend de :
la charge et la polarité
La charge et la polarité dépendent de :
pH et force ionique
La solubilité d’un acide aminé ou protéine est ? lorsque le pH de la solution est égal à son ?. La molécule est alors sous forme de ? (charge nulle), ce qui minimise ?. La solubilité augmente lorsque le pH ?
minimale point isoélectrique zwitterion les interactions avec l'eau se situe de part et d'autre du pI
Faible concentration ionique (sels) =
Forte concentration ionique (sels) =
Salting in, les ions favorisent la solubilité
Salting out, ions des sels accaparent l’eau (moins d’eau dispo pour solubiliser acides aminés et prots) - permet d’obtenir une solution plus concentrée en prots et isoler série de prots différente
Facteurs pour la précipitation d’une protéine (selon solubilité) - relargage/salting out
Solubilité minimale, pH = pI de la protéine, force ionique élevée!!
On peut faire précipiter soit protéines indésirables, soit protéine cible ; après quoi, centrifugation
Si prots indésirables forment précipité, on récupère le surnageant
Si prot cible forme précipité, ça va aussi concentrer prot. Il suffit de se débarrasser délicatement du surnageant et de resolubiliser la protéine dans un plus petit volume de tampon.
Purification selon taille, charge ou affinité : chromatographie sur colonne principe de base
Description
Phase stationnaire = substance insoluble contenue dans la colonne et interagissant avec protéine, varie selon la propriété utilisée pour la purification
Phase mobile = échantillon contenant protéine cible
On fait une élution : ajout continuel de solvant, ce qui entraîne les différents composés de l’échantillon vers le bas de la colonne. Liquide sortant = éluat, vitesse d’élution = vitesse de passage des différents composés dans la colonne (vitesse variable pour chaque protéine)
On récupère éluat sous forme de fractions de volume prédéfini qu’on analyse par spectrophotométrie.
Purification selon la taille =
Phase stationnaire =
En plus de purifier protéine cible, on peut estimer ? à l’aide de cette méthode
Chromatographie d’exclusion (aussi appelée filtration sur gel, chroma sur gel, chroma par tamisage moléculaire, chroma d’exclusion stérique)
Billes de gel contenant des pores de grosseur contrôlé et connue (grosses molécules ne peuvent pas entrer et donc migrent plus vite dans la colonne)
sa masse moléculaire sous sa forme entière (structure quaternaire)
Purification selon la charge =
Phase stationnaire =
Chromatographie par échange d’ions (exploite différence entre les charges nettes des molécules à un pH donné. Les molécules à séparer circulent à travers une colonne contenant des billes inertes et insolubles sur lesquelles sont fixés des groupements anioniques ou cationiques. Les molécules chargées sont retenues sur la colonne dépendamment de leur charge.)
Colonne d’échange cationique avec résine chargée - donc lie cations (charges +) OU colonne d’échange aniotique avec résine chargée + donc lie anions (charges -)
Exemple : utiliser la compétition avec les ions Na+ pour décrocher les composantes du mélange. On peut aussi modifier graduellement pH du solvant, ce qui modifiera charge nette.
Purification selon l’affinité =
Phase stationnaire =
Chromatographie d’affinité (utilise spécificité de la reconnaissance moléculaire)
Polymère lié de façon covalente à un ligand liant spécifiquement la cible
Ligand = coenzyme, substrat, anticorps, etc.
Lorsqu’un mélange de protéines circule à travers la colonne, seule celle qui a une affinité importante pour le ligand est retenue. Les autres protéines migrent avec le flux de solvant. On peut par la suite éluer la protéine cible de 2 façons : en changeant le pH du flux de solvant ou en ajoutant une solution contenant une forte concentration de ligand.
En modifiant ? et ?, on peut précipiter sélectivement les protéines.
le pH et la force ionique
Chromatographie moderne =
Appareil de ?
chromatographie à haute performance
HPLC = high-performance liquid chromatography
Flux de solvant contrôlé par ordinateur
Peut servir à presque tous les types de chromatographie sur colonne, il suffit d’utiliser une colonne qui contient résine appropriée.
On utilise un spectrophotomètre pour mesurer ? par un soluté de la ? à ? donnée.
La spectrophotométrie est utilisée pour ? et ?
l’absorption
lumière
une longueur d’onde
détection et dosage
Loi de Beer-Lambert (2 équations)
A = log Io/I (incidente/transmise) A = ecl (e = coefficient d'extinction molaire)
L’absorbance (densité optique) d’une solution contenant un soluté X est directement ? à sa ?
proportionnelle
concentration
La spectrophotométrie UV est couramment utilisée pour identifier ? qui contiennent des ? lors d’une chromatographie. **MÉTHODE FRÉQUEMMENT UTILISÉE POUR ESTIMER CONCENTRATION PROTÉINE EN SOLUTION
les fractions
protéines
Lorsque coefficient molaire des protéines n’est pas connu, on a recours à la ?. Les protéines seront traitées avec des ? de manière à ce qu’elles absorbent la lumière visible.
spectrophotocolorimétrie
réactifs
On regroupe sous le terme ÉLECTROPHORÈSE les méthodes permettant de ? les composantes d’un mélange en fonction de leur ? dans un gel en présence d’un ?
Les particules doivent traverser le gel (réseau de pores)
Petites molécules =
Grosses molécules =
Contraire à la chromatographie d’exclusion parce que ?
séparer
vitesse de migration
champ électrique
migration rapide
migration plus lente
les grosses molécules ne sont pas exclues
Quels sont les 3 facteurs qui influencent la migration d’une molécule dans un gel?
Charge électrique
Forme
Masse moléculaire
Raisons d’utiliser les méthodes d’électrophorèse (4)
Analyser pureté
Déterminer masse moléculaire
Déterminer pI
Parfois pour purification en prélevant portion de gel contenant la protéine d’intérêt
But en gros de PAGE (électrophorèse sur gel de polyacrymalide) en conditions natives (non-dénaturantes) et SDS-PAGE en conditions dénaturantes
Puits =
Vérifier pureté solution protéique
1- Extrait cellulaire brut
2- Après quelques étapes de purification
3- Protéine purifiée
SDS-PAGE (4 points importants)
- Dénaturation des protéines (destruction de la structure 3D)! Ne sépare plus selon la forme. SDS (détergent) : bris des interactions non covalentes. Agent réducteur : bris des ponts disulfures (B-mercaptoéthanol)
- Uniformisation de la densité de charge par l’ajout de SDS! Ne sépare plus selon la charge. Le ration charge/masse est constant. SDS = chargé -
- Séparation selon la MASSE MOLÉCULAIRE UNIQUEMENT
- Indices sur l’arrangement des sous-unités : identification des ponts disulfures (comparaison échantillons même protéine avant et après traitement par un agent réducteur) ce qui permet d’identifier ponts disulfures et nombre de chaînes polypeptidiques
Focalisation isoélectrique pour ?
Description du concept
Détermination du pI
Gel contenant un gradient de pH (extrémité du haut basique et celle du bas acide)
Lorsque pH = pI, charge nette est de 0, migration s’arrête
Électrophorèse 2D pour ?
Surtout utilisée pour analyser ?
Fait partie des outils utilisés en ?
Les 2 grandes étapes de l’électrophorèse 2D
Détermination de la masse moléculaire et du pI
Mélange protéique
Protéomique
1- Focalisation isoélectrique
2- SDS-PAGE avec gel IEF qui remplace les puits
Protéomique =
Protéome =
étude du protéome
ensemble des protéines d’un organisme
Spectrométrie de masse pour ?
Elle mesure ? que prend une molécule chargée en ? pour voyager dans un tube (temps de vol)
Les 2 méthodes de vaporisation des peptides =
Après vaporisation, les peptides doivent passer dans ? avant le tube
Détermination masse moléculaire et structure primaire des peptides
le temps
phase gazeuse
Ionisation par électrodispersion (ESI) et désorption au laser favorisée par la matrice (MALDI)
un champ électrique
Quelle méthode d’analyse des protéines est la plus précise??
La spectrométrie de masse
Masse précise au proton près
Méthode extrêmement sensible (1 pmol peut suffire)
Résumé des méthodes d'analyse de protéines : Détection et dosage = Vérification de la pureté = Détermination de la masse moléculaire = Détermination du pI = Détermination de la masse et du pI =
spectrophotométrie
Électrophorèse (PAGE ou SDS-PAGE)
Chromatographie d’exclusion (- précis), SDS-PAGE, spectrométrie de masse (+ précis)
Focalisation isoélectrique (IFE)
Électrophorèse 2D (2DE)
Résumé purification d’une protéine
- Sa solubilité (3 façons)
- Sa taille (2 façons)
- Sa charge (2 façons)
- Son affinité (1 façon)
- Salting-out, précipitation, centrifugation
- Chromatographie d’exclusion + électrophorèse
- Chromatographie échange d’ions + électrophorèse
- Chromatographie d’affinité (ligand)
Techniques FRÉQUEMMENT utilisées pour purifier protéines et acides aminés?
HPLC, chromatographies par échange d’ions, d’exclusion, d’affinité.
MOINS SOUVENT électrophorèse
