Wirtszellen & Vektoren Flashcards
Erklären Sie den Aufbau eines Standard-Klonierungs-Plasmids, wie es derzeit üblicherweise in der Gentechnik eingesetzt wird. Welche Komponenten sind essentiell, welche Zusatzfeatures kennen Sie?
Klonieren = Herstellung transgener Organismen durch Einbringen von DNA in einen Vektor, der die Vermehrung dieser DNA ermöglicht
Vektor = Transportvehikel zur Übertragung von Fremd-DNA in eine lebende Empfängerzelle (Plasmid)
Plasmid = zirkuläre dsDNA, kann sich unabhängig vom Genom replizieren
Aufbau
- Replikationsstartpunkt (ori) → zur Reproduktion und Weitergabe im Organismus
- selektierbarer Marker → zum Aufspüren des transgenen Klons (meist Antibiotikaresistenzen)
- singuläre Restriktionsschnittstellen → um rekombinante DNA einzufügen (“cloning site”)
- Insertionsinaktivierung → Resistenz wird bei Insert inaktiviert (geschwächtes Wachstum)
Zusatzfeatures
- Mehrfachklonierungsstelle (MCS) → mehrere Schnittstellen, die alle nur an gewisser Stelle des Vektors vorkommen, jedoch nirgendwo sonst; Einsatzmöglichkeiten des Vektors werden erweitert
- lacZ-Gen → beta-Galactosidase-Gen; ist Insert erfolgreich - keine lacZ-Aktivtität - GalX wird nicht gespalten - weiße Kolonien; Insert nicht erfolgreich - lacZ bleibt aktiv - GalX wird gespalten - blaue Kolonien
Welche Anforderungen werden an prokaryotische Wirtszellen (geeignet zur Aufnahme von DNA-Vektoren) gestellt? Welches Bakterium ist die häufigste Wirtszelle, welche relevanten Informationen sind zu diesem Bakterium verfügbar?
Anforderungen
- muss eine große Auswahl an unterschiedlichen Vektoren akzeptieren
- hohe Kopienanzahl pro Zelle
- viele verschiedene Stämme vorhanden
E. coli
- gramnegativ
- Genom 3*106bp, liegt kompakt als Nukleoid vor
- Trankription und Translation sind eng gekoppelt → neue mRNA wird direkt translatiert
- einfache Insertierung rekombinanter DNA
Shuttle-Vektoren werden von Primärwirt (E. coli) und Sekundärwirt akzeptiert.
Welche grundsätzlichen Plasmid-Typen für E. coli gibt es, durch welche Eigenschaften sind sie ausgewiesen, wofür werden sie verwendet?
- Konjugative Plasmide (Wildtyp) → zur Selbstübertragung von Bakterium zu Bakterium (durch Konjugation) befähigt, tra- und mob-Funktionen (Transfer und Mobilisierung) sind notwendig
- Nicht-konjugative Plasmide (Gentechnik) → nicht zur Selbstübertragung in der Lage, wenn mob-Funktion aber intakt, können sie mithilfe einen Konjugationsplasmids mobilisiert werden
- Plasmide mit niedriger Kopienzahl → stringente Kontrolle, enge Kopplung der Replikation an die des Wirtschromosoms, z.B. Expressionsplasmide, oft konjugative Plasmide
- Plasmide mit **hoher Kopienzahl **→ relaxierte Kontrolle, Entkopplung der Replikation von der des Wirtschromosoms, z.B. Klonierungsvektoren, nicht-konjugative Plasmide
Skizzieren Sie ein auf pBR322 beruhendes DNA-Insertionssystem, welche Selektionsschritte sind notwendig?
p…Plasmid
BR…Initialen
- ..Isolat-Nr.
ori. ..origin of replication
Antibiotika-Resistenzen: Apr (Ampicillin), Tcr (Tetracyclin)
Singuläre Restriktionsschnittstellen: PstI, PvuI, EcoRI, BamHI, SalI
→ durch Einbringen eines Inserts verlieren die Transformanten die jeweilige Resistenz.
→ Selektion nach Insertionsinaktivierung: durch Insertion rekombinanter DNA in BamHI/SalI kommt es zur Inaktivierung eines Gens (Tcr) → E. coli mit Plasmid kann über Tetracyclin-Platten selektiert werden
Wo liegen die Limitierungen von Plasmid-Vektoren, welche Alternativen kennen Sie?
Limitierungen
- Größe der insertierbaren Fragmente (>5kb problematisch)
- ungeeignet für Genombibliotheken, Genombanken
Alternativen
- Bakteriophagen (Viren, die sich mithilfe von Bakterien vermehren)
- Cosmide
- BACs und YACs
Beschreiben Sie die beiden Lebenszyklen des lambda-Phagen!
Virulente Phagen → lytischer Lebenszyklus
dringen in die Zelle ein, neue Phagenpartikel werden synthetisiert und freigesetzt (Lyse = Freisetzung), Zelle stirbt (Plaques)
Temperente Phagen → lysogener Lebenszyklus (Prophage)
Töten Zelle nicht, dringen in die Zelle ein, werden durch lambda-Repressor gesilenced und befinden sich in Ruhestadium, bis Bedingungen geeignet sind (Stoffwechsel/Ernährungszustand der Zelle) und gehen dann durch Zerstörung des lambda-Repressors in lytischen Zyklus über. Pseudoplaques.
Vergleichen Sie den Aufbau des lambda- mit dem des M13-Phagen. Vergleichen Sie alle Infektionsmechanismen und den Infektionsverlauf!
lambda-Phagen: Genom ist 48,5kb groß (in Capsid enthalten), 46 Gene, ss komplentäres Ende (12bp) für Ringschluss
Infektionsverlauf
- Adsorption auf der Bakterienoberfläche
- DNA wird in Wirtsgenom injiziert
- Ringschluss
- lytischer oder lysogener Zyklus
M13-Phage: tötet Wirt nicht! Filamentöser Phage, zirkuläre ssDNA als Genom (6407bp)
Infektionsverlauf
- Infektion über die F-Pili von E. coli (Konjugation - horizontaler Gentransfer)
- ssDNA wird im Wirt zu dsDNA → replikative Form (RF) des Phagen
- zunächst werden ca. 100 Kopien synthetisiert - dann asymmetrische Vermehrung
- es entstehen ssDNA-Kopien → werden als M13-Partikel ausgeschleust
- Bakterien lysieren nicht → lediglich beeinträchtigtes Wachstum (“Pseudoplaques”)
Beschreiben Sie die lambda-Phagen gt10, Charon 16A, EMBL4 und Charon 40, erklären Sie deren Besonderheiten.
gt(10) → Insertionsvektor, Insertgröße 7,6kb, cI codiert für lambda-Repressor, Zerstörung von cI - lytischer Zyklus (Selektion: leerer Vektor bleibt lysogen)
Charon16A → Insertionsvektor, Insertgröße 9kb, Selektion über Insertionsaktivierung von lacZ (X-Gal), bei Insertion weiße Kolonien
EMBL4 → Replacementvektor, Insertgröße 9-22kb, Stuffer kann durch zusätzliche SalI-Schnittstellen funktionslos gemacht werden
Charon40 → Replacementvektor, Poly-Stuffer wird durch NaeI in mehrere kleine Fragmente geschnitten, MCS bietet Vielzahl von Insertionsmöglichkeiten
Was versteht man unter lambda-Replacement-Phagen, worauf beruht das Prinzip, welche Fremd-DNA-Größen können verpackt werden?
Insertionsvektoren → besitzen nur 1 Schnittstelle, an der Fremd-DNA eingebaut werden kann
Replacementvektoren → Mittelteil des Phagen wird freigesetzt (2 Schnittstellen), anstelle des “Stuffers” wird Fremd-DNA eingefügt. Insertgröße 9-22kb
Skizzieren Sie einen vom M13-Phagen abgeleiteten Vektor, wofür werden diese hauptsächlich verwendet?
→ in Form eines Plasmids
- sehr effizient organisiertes Genom, nur 507bp veränderbar
- MCS und lacZ’ wurden eingesetzt (für XGal-Test)
- Insertgröße theoretisch unbegrenzt
- Fragmente von > 1,5kb aber gesenkte Klonierungsfrequenz
- zur Herstellunge von ssDNA (Sonden, Sequenzieren)
- große Bedeutung für Phage-Display
Was versteht man unter Cosmiden und Phagmiden, nennen Sie Beispiele!
Cosmid
→ Plasmid, in dem man die 10-fache DNA-Menge verpacken kann, ist mit cos-Stellen versehen zum Zirkularisieren. DNA zwischen 2 cos-Stellen wird nur ein einer Größe von 38-51kb verpackt. Cosmidgröße: nur 4-6kb, bis ca. 47kb Fremd-DNA möglich (z.B. SuperCos)
Phagmid
→ Hyrbid aus Plasmid und Phage, bei dem Phagenfunktionen exprimiert sind
lambda-ZAP-System - Insertionsvektor: die in Phagen klonierte DNA kann in vitro oder in vivo als Plasmid herausgeschnitten werden
pEMBL9, pBluescript: Plasmide mit dem Replikationsstartpunkt von M13. Werden plasmidehältige Zellen mit M13 überinfiziert, wird ss-Plasmid-DNA produziert und ausgeschleust
Benennen Sie die wesentlichen Gruppen von Hefe-Plasmiden, welche Eigenschaften unterscheiden sie?
Episomale Hefeplasmide (YEPs) → natürlich vorkommende Hefeplasmide (2µm Hefeplasmid), integrieren sich in das Chromosom oder replizieren sich autonom
Integrative Hefeplasmide (YIPs) → werden ähnlich wie YEPs Bestandteil des Chromosoms
Replikative Hefeplasmide (YRPs) → bleiben unabhängig und setzen sich nicht im Chromosom fest
Hefe-Centromer-Plasmide (YCPs) → beinhalten Sequenzen aus dem Centromer-Bereich, verhalten sich wie Minichromosomen
Nennen Sie Vektoren zur Transformation von tierischen oder pflanzlichen Zellen!
Pflanzenzellen - Plasmide - DNA - Ti-Plasmid aus Agrobacterium tumefaciens
Pflanzenzellen - Viren - DNA - Blumenkohlmosaikvirus, Geminiviren
Pflanzenzellen - Viren - RNA - Tabakmosaikvirus
Tierzellen - Plasmide - DNA - verschiedene Vektoren, häufig Hybridvektoren
Tierzellen - Viren - DNA - SV40, Papillomvirus, Baculovirus, Vacciniavirus
Tierzellen - Viren - RNA - Retroviren
Tierzellen - Transposons - DNA - P-Elemente in Drosophila melanogaster
Was versteht man unter BACs und YACs?
YACs = yeast artifical chromosome
- Fremd-DNA über 1Mb kann aufgenommen werden
- weisen centromere und telomere Regionen auf
- rekombinante DNA verhält sich wie Hefechromosom
- Stabilitätsprobleme
BACs = bacterial artifical chromosome
- abgeleitet vom F-Plasmid (verleiht Bakterium die Fähigkeit zur Konjugation, horizontaler Gentransfer)
- Fragmentgröße bis zu 500kb möglich
- keine Stabilitätsprobleme
- Genomprojekte setzen auf BAC-Libraries (z.B. Human Genome Project)
Geben Sie eine Liste der gängisten Vektor-Systeme mit einer Zuordnung zu ihren größten DNA-Inserten an!
Plasmid: 3-5kb
Phagmid: 10kb
Phage: 20kb
Cosmid:50kb
BACs: 300-500kb
YACs: 1000kb, Stabilitätsprobleme
