Ausgewählte Methoden der Gentechnik Flashcards
Beschreiben Sie das Prinzip des Two Hybrid System, erklären Sie die wesentlichen Unterschiede zum One Hybrid System!
Hefe-2-Hybrid-System = Technik zur Aufklärung von Protein/Protein-Interaktionen
→ Transkriptionsfaktor (z.B. Gal4) besteht aus 2 verschiedenen Domänen
- DNA-Binde-Domäne (DBD): bindet spezifisch an Zielsequenz
- Aktivierungsdomäne (AD): aktiviert RNA-Polymerase (zur Transkription des Reportergens)
→ räumliche Nähe von DBD und AD essentiell für die Aktivierung der RNA-Polymerase II
→ normalerweise DBD und AD auf derselben Polypeptidkette, beide Domänen aber auch dann wirksam, wenn sie durch nonkovalente Protein-Protein-Interaktionen verbunden sind
Funktionsprinzip
- DBD und AD werden als Hybridproteine eingesetzt (bait-DBD und prey-AD-Fusionsproteine)
- keine bait-prey-Interaktion → keine RNA-Polymerase II-Aktivierung → kein Reportergen-Transkript
- bait-prey-Interaktion → AD aktiviert RNA-Polymerase II → Reportergen wird transkribiert
- Reportergen: z.B. LacZ (XGal-Farbtest)
- Fusionsproteine (bait und prey) werden mithilfe von 2 Plasmiden eingebracht
- Hefe wird mit beiden Plasmiden transformiert
- Nachweis der bait-prey-Interaktion auf Selektionsmedium → blau, falls Interaktion (lacZ wird exprimiert)
Anwendung: Definition von Bindedomänen, Identifizierung neuer Bindungspartner
Hefe-1-Hybrid-System = Technik zur Aufklärung von Protein/DNA-Interaktionen
Prinzip
- Unbekannte DBD: AD wird an unbekanntes Protein fusioniert → falls unbekanntes Protein an DNA bindet, wird Reportergen über AD-Fusion aktiviert
- Unbekannte DNA-binding-site (DBS): AD wird an DNA-bindendes Protein fusioniert → Sequenz kann variiert werden, um DNA-Spezifität zu analysieren (mittels Datenbank); durch **Mutationsstudien, **Identifikation von DBD bzw. DBS
Was versteht man unter dem One bzw. dem One and a half Hybrid System?
Hefe-1-Hybrid-System = Technik zur Aufklärung von Protein/DNA-Interaktionen
Funktionsprinzip
- Unbekannte DBD: AD wird an unbekanntes Protein fusioniert → wenn DNA an unbekanntes Protein bindet → Aktivierung des Reportergens
- Unbekannte DBS (DNA-binding-site): AD wird über Fusion an DNA-bindendes Protein fusioniert → Sequenz kann variiert werden, um Spezifität festzustellen (mittels Datenbank)
Awendung: Mutationsstudien, Indentifizierung von DBD und DBS
Hefe-1,5-Hybrid-System
Hefe-1-Hybrid-Protein wird zusammen mit unbekanntem Protein co-exprimiert (an DBD) → Identifikation von regulatorischen Proteinen, welche Transkriptionsaktivität beeinflussen
Was versteht man unter dem Tri Hybrid System, welche unterschiedlichen Formen kennen Sie?
Zusätzlicher Faktor wird benötigt, um Hybridproteine interagieren zu lassen.
Bei geringer Affinität zwischen den Hybridproteinen X/Y → Reporteraktivität unter Detektionslevel
Affinitätserhöhung durch
→ dritte Komponente (RNA, DNA, Protein)
→ posttranslationale Modifikationen
Worin liegt die Hauptlimitierung des Two Hybrid Systems, welche Alternative kennen Sie?
Beide Hybridproteine (bait & prey) müssen vom Cytoplasma in den Zellkern gelangen! Membranproteine können Kernmembran nicht passieren → daher ungeeignet für Y2H
Alternative - Split Ubiquitin
Interaktion zwischen Membranproteinen X/Y (Ubiquitinierung) → führt zu Ubiquitinsignal (= Signal für proteolytische Spaltung) → DBD und AD-Domänen werden von Membranproteinen X/Y abgespalten und in den Zellkern transportiert
Erklären Sie die Wirkungsweise eines ausgereiften Two Hybrid System, welches ein Two Parallel Reporter System verwendet!
Bei Verwendung von nur einem Reportergen kann es zu falsch-positiven Ergebnissen kommen!
→ Verwendung von 2 Reportergenen mit Selektionsmarkern (z.B. Leu und His)
→ bei bait-prey-Interaktion: Wachstum auf Selektivmedium
Welche Varianten/Kombinationsmöglichkeiten von bait/Ligand/Reporter gibt es im Two Hybrid System?
bait: Gal4, cI, tetR, LexA
prey: Gl4, B42, VP16
Reporter: lacZ, HIS3, URA3, ADE2, Lys2, Leu2, GusA
Was versteht man unter dem Begriff Reportergen, welche Reportergene kennen Sie (nennen Sie mind. 6)!
Reportergen → zur Promotor- oder Fusionsproteinanalyse; mithilfe des Reportergens können bestimmte Qualitäten/Effekte anderer Gene gezeigt werden
- hph - Hygromycin-Phosphotransferase - Wachstum in Gegenwart von Hygromycin B
- CAT - Chloramphenicol-Acetyltransferase - Wachstum in Gegenwart von Chloramphenicol
- lacZ - beta-Galactosidase (für Pflanzen ungeeignet) - Chromogenes Substrat (XGal)
- GUS - beta-Glucuronidase - Chromogenes Substrat
- GOX - Glucose-Oxidase - Chromogenes Substrat
- Lux - Luciferin (bakterielles, Insekten) - Fluoreszenz
- GFP - Green Fluorscent Protein - Fluoreszenz
Worauf beruhen die unterschiedlichen Reportergen-Nachweise, nennen Sie Beispiele und Methoden!
Nachweis kann durch Farbreaktion, Biolumineszenz oder Fluoreszenz erfolgen!
lacZ - beta-Galactosidase-Gen
- E. coli: blau-weiß-Selektion von Kolonien
- Hefen: z.B. Hefe-2-Hybrid-System
- höhere Organismen, z.B. knock-out-Maus
- Hydrolyse von X-Gal zu → Galactose + blauer Farbstoff → gibt Expression von lacZ an
GUS - Glucuronidase-Gen
- Nachweis der Enzymaktivität
- je nach Anwendung (histochemisch, spektralphotometrisch, fluorimetrisch) werden unterschiedliche Substrate verwendet
GOX - Glucose-Oxidase-Gen
- Glucose-Oxidase oxidiert Glucose zu Glucuronsäure + Wasserstoffperoxid
- Wasserstoffperoxid wird in nachgeschalteten Farbreaktionen zu Wasser reduziert → Oxidation des farblosen ABTS zu intensiv grün gefärbtem ABTS+ → Dimerisierung von pHPPA - fluorimetrische Bestimmung
Lux - Luciferase-Gen
- strukturell unterschiedliche Enzyme, in deren Anwesenheit Luciferine oxidiert werden, es kommt zu Biolumineszenz
- Firefly-Luciferasen: benötigen Luciferol, ATP und Sauerstoff
- Renilla-Luciferasen: benötigen nur Luciferol und Sauerstoff
GFP - Green Fluorescent Protein
- Protein aus 238 AS der Qualle Aquorea victoria
- Anregung mit blauem oder UV-Licht → grüne Fluoreszenz
- eigentlicher FLuorophor bildet sich autokatalytisch aus Tripeptidsequenz Ser65-Tyr66-Gly67
- Versionen des Original-GFP mit anderen Fluoreszenzspektren, CFP (cyan), YFP (yellow)
Was ist GFP und worin liegen seine Hauptvorteile?
Anwendungen
- Kopplung mit Viren, um Infektionswege zu sehen
- fluoreszierende Tumorzellen
- Kopplung an Proteine, um zelluläre Strukturen zu sehen
- Marker für Expression von Genen
- fluoreszierende Tiere: Fische, Mäuse, Schweine
Vorteil: nicht toxisch, Fluoreszenzmikroskopie: räumliche und zeitliche Lokalisation des Zielproteins
Erklären Sie die Technik des Phage-Displays, welche Interaktionen können nachgewiesen werden?
Phage Display = gentechnische Methode, um Interaktionen mit von **ProteinenmitProteinen, Nukleinsäuren u.a. Liganden(Hormone, Antibiotika, etc.) zuselektieren**.
Prinzip
- aus Pool von in vitro synthetisierten, rekombinanten DNA-Konstrukten werden bestimmte Eigenschaften selektiert
- Methode, um vollkommen neue Proteine (AK, Enzyme, Rezeptoren) zu erhalten
Grundlage - Vermehrungszyklus
- M13-Phage, ssDNA, 6,5kb, Genom codiert für 10 Proteine
- Phage infiziert Bakterium via F-Pili (Konjugation - horizontaler Gentransfer)
- infizierende ssDNA wird in dsDNA überführt (replikative Form)
- Phagenproteine steuern ssDNA-Phagen-Synthese
- ssDNA wird an Membran in Phagen-Hüllprotein verpackt
- Nachkommenphagen verlassen Wirt ohne Lyse - lediglich Wachstum beeinträchtigt
Beschreiben Sie die einzelnen Schritte beim Phage Display, nennen Sie Beispiele für die Anwendung!
Funktionsweise
- rekombinante DNA wird ins Genom des M13-Phagen eingebracht
- Fusion mit dem pIII-Gen (=g3p, Zweidomänen-Hüllprotein
- Fusionsprotein wird an Oberfläche präsentiert → erlaubt Selektion der Phagen nach Affinität zu einem bestimmten Molekül (Affinitätschromatographie)
- Phänotyp-Genotyp-Kopplung ist gewährleistet durch Verpackung der codierenden Sequenzen im Phagen-Genom (Protein erscheint auf Hülle = Phänotyp, Gen im Inneren = Genotyp)
Anwendung: Medikamentenherstellung, Protein-Protein-Interaktionen (Antikörper), Substrate und Inhibitoren für Enzyme, Protein- und Peptidbanken
Vergleichen Sie die Technik Phage Display mit der Zelloberflächen-Präsentation in intakten Zellen, wo liegen die jeweiligen Vorteile?
Zelloberflächen-Präsentation stammt vom Phage Display ab.
Prinzip ist gleich
- DNA-Fragmente werden in Plasmid eingebracht
- exprimierte Proteine werden mithilfe von Carrierproteinen auf der Zelloberfläche verankert (fusioniert)
- Bindung mit Substrat je nach Affinität
- waschen - Elution - Amplifikation
Voraussetzung
- Carrier sollte effiziente Sekretion vermitteln
- Carrier sollte stabil und proteaseresistent in Membran verankert sein
- Carrier sollte weder Faltung noch Aktivität des präsentierten Proteins beeinträchtigen
Vorteil: Es können größere Proteine als beim Phage Display an der Zelloberfläche präsentiert werden.
Anwendung
- Lebendvakzine
- Screening für Bindemoleküle
- Antigen-Präsentation für Antikörpergewinnung
- Bioadsorbantien (Umweltgifte, Schwermetalle)
Erklären Sie die Zelloberflächen-Präsentation in intakten Zellen am Beispiel von Ciliaten als Expressionssystem!
Prinzip
- DNA wird in Plasmid eingebracht
- exprimierte Proteine werden über Carrierproteine an der Zelloberfläche verankert
- Bindung mit Substrat je nach Affinität
- waschen - Elution - Amplifikation
Vorteil von Ciliaten als Expressionssystem
- Ciliaten-Expressionssysteme sind apathogen
- kurze Generationsdauer (1,5-3h)
- hochzelldichte Fermentation möglich
Was versteht man unter Ribosomen-Display?
Ribosomen-Display = in vitro-Protein-Biosynthese. Normalerweise zerfällt nach der Translation der Ribosom-Protein-mRNA-Komplex, DNA-Abschnitte können dann den Proteinen, für die sie codieren, nicht mehr zugeordnet werden.
Prinzip
- DNA-Bank wird (z.B. nach in vitro-Mutagenese) mithilfe eines in vitro-Transkriptionssystems in entsprechende mRNA transkribiert und gereinigt
- Translation im zellfreien System (durch Inkubation auf Eis gestoppt, Stabilisierung durch MgCl2)
- Ribosomen-Protein-mRNA-Komplex wird mit immobilisierten Liganden (z.B. Antigen) inkubiert (panning), unspezifische Komplexe werden eluiert
- RNA wird aus den Komplexen isoliert, in cDNA überschrieben (durch RT) und durch PCR amplifiziert
- DNA steht für neuen panning-Zyklus zur Verfügung
