Expression von rekombinanten Proteinen Flashcards
Erklären Sie die Regelmechanismen für die Expression des Zielgens in einem E. coli pET-Expressionssystem. Erklären Sie die wesentlichen genetischen Stukturen und Mechanismen im Wirtsorganismus (E. coli) und im Vektor (pET15).
Die Expression von Zielgenen wird im pET-System auf mehreren Ebenen kontrolliert (double-lock).
Wirt (E. coli): modifiziertes System
- E. coli enhält Gen für T7-Polymerase (im Chromosom integriert), über Lac-Promotor kontrolliert
- LacI = Gen für Lac-Repressor, verhindert Expression der T7-Polymerase
pET-Vektor
- enthält Zielgen - unter Kontrolle des T7-Promotors
- T7 Promotor benötigt T7-Polymerase, um Zielgen zu transkribieren
- LacI-Gen auf Vektor = weitere Induktionskontrolle
- T7 Lysozym inhibiert basale Mengen an T7-Polymerase
Die Wirtszelle wächst ohne IPTG und ohne Expression des Zielgens. Bei optimaler Zelldichte konzentriert sich der gesamte Bakterienstoffwechsel auf die Produktion (auch toxisch). Durch Lactose oder IPTG (Lactose-Analogon) verdrängt der Lac-Operator den **Lac-Repressor **→ Expression der T7-Polymerase → Expression des Zielgens
Was versteht man unter Fusionsproteinen, welche Fusionspartner (Proteine und Tags) kennen Sie, welche Funktionen können die Fusionspartner übernehmen?
Fusionsproteine: entstehen durch gemeinsame Expression 2er Gene, die hintereinander im Genom liegen. Durch Entfernung des Stopp-Codons hinter dem 1. Gen oder durch Verschmelzung → beide Gene werden so abgelesen, als ob es sich um ein einziges handeln würde
- Erhöhung der Proteinstabilität
- Erhöhung der Löslichkeit
- Affinitätsreinigung
Fusionspartner - Herkunft - Mw - Reinigung durch
Maltose-Bindeprotein (MBP) - E. coli - 43kDa - Amyloseharz
Glutathion-S-Transferase - S. japonicum - 26kDa - Glutathion
Tags
Poly-Histidin - synthetisch - 1kDa - Ni-Agarose
Strep II - synthetisch - 1kDa - Streptavidin
FLAG - synthetisch - 1KDa - Anti-FLAG-Antikörper
Erklären Sie die Reinigung eines rekombinant hergestellten Proteins mittels Affinitätschromatographie und proteolytischer Spaltung!
Affinitätschromatographie
- Inkubation des Zellextraktes mit der Affinitätsmatrix
- Bindung des Fusionsproteins an die Affinitätsmatrix
- Waschen der Matrix
- Elution der gebundenen Proteine
proteolytische Spaltung
- nach gemeinsamer Expression des Fusionsproteins und des Targetproteins → Protease spaltet Fusion
Erklären Sie eine gentechnische Methode, um die Codon-Usage eines Organismus zu beeinflussen, nennen Sie ein Beispiel!
Codon Usage
→ Varianten des universellen genetischen Codes, werden von verschiedenen Spezies unterschiedlich häufig genutzt, bestimmte Codons werden bevorzugt benutzt (entspricht tRNA-Konzentration in der Zelle)
- selten verwendete Codons bremsen Translation
- häufig verwendete Codons beschleunigen Translation
Gentechnische Beeinflussung:
Durch Einbringen der benötigten tRNAs mittels Plasmid in den Organismus → höhere Expression des Proteins (falls tRNA-Konzentration im Organismus zu niedrig)
Plasmid pRARE codiert tRNAs für die in E. coli selten genutzten Codons (enthält lac-Repressor und T7-Lysozyme)
Skizzieren Sie einen Hefe-E. coli-Expression-Shuttle-Vektor, warum wird eine derartige Strategie angewendet?
- bietet Möglichkeit, in 2 Wirten eingesetzt zu werden (Hefe: PTMs - Glykolysierung möglich)
- Shuttlevektor enthält 2 oris und 2 Selektionsmarker für 2 unterschiedliche Organismen
- induzierbarer Promotor: erst dann aktiv, wenn bestimmte Substanz zugegeben wird → Zeitpunkt der Expression bestimmbar
- Nachteil: geringe Ausbeute, Überglykolysierung
Warum sind Pichia-basierende Expressionsysteme denen von Saccharomyces vorzuziehen, benennen sie Vor- und Nachteile!
Pichia pastoris
- methylotrophe Hefe (MeOH als C-Quelle, billiger)
- hohe Expressionraten (wie E. coli)
- Sekretion rekombinanter Proteine in Kulturmedium
- einfache Handhabung
- Wachstum zu hohen Zelldichten
- Expression im Hochdurchsatzverfahren
- Nachteil: hängt in Agglomeraten zusammen
Saccharomyces cerevisiae
- Zucker als C-Quelle (teurer)
- geringere Expressionraten
- Überglykolysierung
- geringere Ausbeuten
- einige PTMs
Wie funktioniert ein Integratives Plasmid bei Pichia?
lineares Fragment mit Gen von Interesse und Selektionsmarker wird durch
→ homologe Rekombination in Alkohol-Oxidase-Gen (AOX) integriert (homologe dsDNA-Abschnitte)
→ kommt somit unter Kontrolle des AOX-Promotors
Wie funktioniert das Baculovirus-Expressionssystem in Insektenzellen, wie werden die Expressionsvektoren hergestellt?
Baculovirus: dsDNA-Viren, die spezifisch Insektenzellen transfizieren
Funktionsweise
- in virales Genom integrierte Fremdgene → werden in befallen Insektenzellen exprimiert
- durch hohen Virustiter → hohe Expressionsraten
- Mehrzahl der exprimierten Proteine bleiben in Zelle gelöst
- Insektenzellen werden in Suspensionen kultiviert → erlaubt variablen Kulturmessstab
Herstellung: durch homologe Rekombination des Virus-Genoms mit der Transferkonstrukt in der Insektenzelle
Wie erfolgt heterologe Proteinexpression in Säugetierzellen, wie wird die DNA eingeschleust?
Transfer der DNA in Säugerzellen
- direkt mit Plasmiden: Transfektion (z.B. Elektroporation, Microinjection, Gene Gun)
- Infektion mit Viren: Adenoviren, SV40, Retroviren → hohe Transfektionsraten, jedoch S2-Labor!
Was versteht man unter zellfreien Expressionssystemen, welche Arten kennen Sie?
Auch Zell-Lysate können mRNA in vitro translatieren (Zelle nicht unbedingt erforderlich)
Zellfreie Expressionssysteme
- Expression: erfolgt von zirkulären Plasmiden oder direkt von PCR-PRodukten mit entsprechendem Promotor
- benötigt keine Klonierungsschritte oder Manipulation von Wirtszellen, extrem schnell
- im Hochdurchsatz einsetzbar
- ermöglicht Expression von toxischen Proteinen
- verschiedene Zell-Lysate werden in der Praxis eingesetzt: E. coli, Kaninchen-Reticulocyten, Weizenkeim-Extrakt
E. coli-Extrakt: hohe Ausbeuten, kann seltene AS und AS-Analoga einbauen (wichtig für Strukturaufklärung), führt keine PTMs durch
Reticulocyten/Weizenkeimextrakt: niedrige Ausbeuten, kann keine AS-Analoga einbauen, führt viele PTMs korrekt aus
Benennen Sie die Einzelkomponenten eines zellfreien Expressionssystems, wo liegt dessen Limitierung und wie kann diese technisch gelöst werden?
Einzelkomponenten
- Zellextrakt (E. coli, Weizenkeim, Reticulocyten) mit Ribosomen, Efs, RNA-Polymerase etc.
- template DNA/RNA
- Substrate (NTPs, AS, etc.)
- Puffer und Salze
Limitierung
Energieverfügbarkeit (ATP) limitiert Ausbeute!
Lösung: continuous-flow und continuous-exchange cell-free system → template wird in Reaktor eingefügt, Substrate werden durch semipermeable Membran in Reaktor nachgeliefert → Protein wird exprimiert und durch UF abgetrennt.
