Chromatin Flashcards
Chromatin, wie nennt man die kleinste Packungseinheit und wie ist sie aufgebaut? Welche Teile davon sind variabel und welche in allen Organismen gleich? Wie bestimmt man die Größe des nicht-variablen Teils? Zu welchem Packungsausmaß der DNA trägt diese Grundstruktur bei und welches Protein wird sie zusätzlich erhöht?
Nukleosom
- kleinste Einheit des Chromatins
- aufgebaut aus DNA und 8 Histonen: Core-Histone 2xH2A, 2xH2B, H3 und H4 (durch Evolution außerordentlich konserviert)
- Linker-Histon H1: sorgt für dichtere Verpackung: variabel und in manchen Organismen gar nicht vorhanden
- Größe des Core-Nukleosoms: durch Verdau mit Nuklease und Gelektrophorese bestimmt
Chromatin
- besteht aus der DNA, die um die Histone gewickelt ist, sowie weiteren Proteinen, die sich an die DNA anlagern
- Komprimierung des DNA-Moleküls (ohne H1): Faktor 7
- Histon H1 erlaubt nächsthöhere Verpackungseinheit der DNA: Faktor 40-50
Heterochromatin: Woher stammt diese Bezeichnung, was beschreibt sie und wie heißt die gegenteilige Erscheinungsform? Welche Bereiche des Chromosoms sind besonders davon betroffen und welchen Anteil hat HC in Säugern allgemein? Beschreiben Sie, welche Art der Genregulation damit oft in Zusammenhang steht und die Bedeutung dessen!
Heterochromatin
- stärkere Färbbarkeit (durch höhere Kondensation - höhere Konzentration von DNA)
- inaktive DNA (DNA liegt in spiralisierter, an Histone gebundener dsDNA vor
- Euchromatin: Gegenteil - DNA ist aktiv - kann zu Proteinen exprimiert werden
- besonders betroffene Bereiche: Telomere und Centromere
- Anteil in Säugern 5-10%
- Arten der Genregulation durch HC:
- um Gendosis eines weiblichen Säugers aufrechtzuerhalten - ein X-Chromosom in jeder somatischen Zelle stillgelegt “barr bodies” (heterochromatisch)
- Gene silencing
- epigenetische Veränderungen durch z.B. chemische Modifizierungen der Histone (Übergang zwischen HC und EC)
Histon-Modifikationen: Was sind Histone? Nennen Sie 4 Arten von Modifikationen und die entsprechenden Enzyme und wo am Histon diese ganz allgemein passieren? Nennen Sie ein beliebiges Beispiel (d.h. eine AS eines Histons) und beschreiben Sie 3 verschiedene Modifikationszustände und deren Auswirkungen!
- Histone: basische Proteine, Bestandteil des Chromatins - für Verpackung der DNA wichtig
- Acetylierung: durch Histon-Acetyltransferasen, ausschließlich an Lysinen (zur Neutralisierung der positiven Ladung)
- Methylierung: Histon-Methyltransferasen, an Lysinen und Argininen
- Phosphorylierung: durch Histon-Kinase, an Serinen, Threoninen, Tyrosinen (AS mit OH-Gruppe)
- Ubiquitinylierung: durch E1, E2 und E3 an Lysinen
Beispiel: Histon H3
- an K9 (Lysin an 9. Stelle) Acetylierung begünstigt Transkription
- an K4 Methylierung: an Promotoren von transkribierten Genen - Gene silcencing
- an T3 Phosphorylierung: Aktivierung von Transkriptionsfaktoren
Beschreiben Sie, wie ein transkriptionelles Silencing mit Histon-Modifizierung in Verbindung stehen kann!
Hemmung der Transkription, d.h. der genetischen Information von DNA zu mRNA = Resultat von DNA-Methylierung oder Histonmodifikationen - heterochromatischer Zustand wird um Gen geschaffen - verwehrt Transkriptionsmaschine (RNA-Polymerase, etc.) zu binden - Gen kann nicht abgelesen werden
DNA-Methylierung: Welches Enzym bewirkt dies, welches Produkt entsteht und welche Mutation kann sich daraus ergeben? Welche Bereiche der DNA sind häufig betroffen, was bewirkt dies jeweils und welche regulatorische Konsequenz ergibt sich für ein Gen daraus? Beschreiben Sie, wie dieser Zustand oft weiter verstärkt und stabilisiert wird!
DNA-Methylierung
- durch DNA-Methyltransferase
- Produkt: 5-Methyl-Cytidin - Punktmutation C-T (durch Cytidin-Deaminase)
- CG-Methylierung - Methyl-CG erkennende Proteine binden - Verdichtung der Nukleosomen - DNA für RNA-Polymerase nicht ablesbar - Gen ist inaktiv
- Regulatorische Konsequenz:
CG-Paar kommt wesentlich seltener vor als andere Paarungen
erhalten gebliebene CG-Dinukleotide: häufig in Promotoren - verhindert Aktivität in Gen
Verstärkung/Stabilisierung des Zustandes: durch Selektion - wird CG und TG-Paar umgewandelt und dadurch die Existenz der Zelle gefährdet - Veränderung wird nicht vererbt
Was beschreibt der Begriff genetische Prägung im Allgemeinen? Erklären Sie einen möglichen regulatorischen Mechanismus an einem Beispiel!
Genetische Prägung: elternspezifishe Ausprägung von Genen. Entweder nur die von der Mutter stammende oder nur die vom Vater stammende Version eines Gens ist aktiv.
Bsp. Rett-Syndrom (RTT) = Art schwere Autismus, nur Mädchen betroffen
Mutation am MeCP2-kodierenden, X-lokalisiertem Gen (während Meiose). MeCP2 = Transkriptionsfaktor, der selektiv an methylierte CpG-Inseln bindet - Transkription verschiedener Gene ist reprimiert
Epigenetik: Was bedeutet der Begriff und wer hat ihn ursprünglich geprägt und in welchem Zusammenhang? Welche Mechanismen der Epigenetik kennen Sie, was sind ihre Merkmale und welcher bedeutsame Unterschied ergibt sich daraus?
Begriff
- von Conrad Waddington geprägt (Untersuchungen an Straußen)
- gr. Vorsilbe epi bedeutet über, oberhalb, außerhalb
- befasst sich mit Zelleigenschaften (Phänotyp), die auf die Tochterzellen verbt werden und nicht in der DNA-Sequenz (dem Genotyp) festgelegt sind
- Studium der Vererbung von Genexpressionsmustern, die ohne eine Änderung der DNA-Sequenz auftreten
Mechanismen
- Cis-Epigenetik: Mendel - Mutationen am Histon-Ende haben direkten Effekt auf die DNA selbst
- trans-Epigenetik: nicht Mendel - Mutationen am Histon-Ende wirken indirekt auf DNA ein
Nennen Sie ein Beispiel für epigenetische Genregulation!
Erhaltungsmethylasen!
Beschreiben Sie die Funktion und Bedeutung von Erhaltungsmethylasen sowie den Unterschied zu DNA-Methyltransferasen. Warum kann dabei von einem epigenetischen Mechanismus gesprochen werden?
- Erhaltungsmethylasen
sorgen während der DNA-Replikation dafür, daß bereits methylierte Cytosine methyliert bleiben, unmethylierte Cytosine werden jedoch nicht methyliert (werden von Erhaltungsmethylasen nicht erkennt) - Methylierungsmuste bleibt erhalten! Vererbung von Genexpressionsmustern ohne Änderung der DNA-Sequenz (Epigenetik)
- DNA-Methyltransferasen
Enzyme, die Methylgruppen auf Nukleinbasen der DNA übertragen. De novo-Methyltransferasen erkennen spezifische Stellen in der DNA - um Cytosin de novo zu methylieren (in früher Embryonalentwicklung - Methylierungsmuster werden aufgebaut.
Zwei eukaryontische Organismen derselben Gattung und Art zeigen einen unterschiedlichen Phänotyp, die beiden Genome zeigen im Vergleich keine nennenswerten Unterschiede. Nach Fusion von Zellen aus beiden Organismen und anschließender Vereinzelung erhalten Sie einkernige Zellen, die beide Phänotypen im Verhältnis 1:1 widerspiegeln. Handelt es sich um Genetik, um cis- oder trans-Epigenetik?
Cis-Epigenetik!
ChIP: Wofür steht die Abkürzung, was allgemein untersucht man mit dieser Technik und welche Art von Proteine sind oft involviert? Nennen Sie Methoden der Analyse mit denen ChIP kombiniert wird und vergleichen Sie diese (Vor- und Nachteile)!
ChiP = “chromatin immunoprecipitation” - Analyse der Chromatinstruktur, Ziel: feststellen, ob bestimmten Teile des Chromatins lebende Zellen binden
häufig untersuchte Proteine
- Transkriptionsfaktoren
- chromatinmodifizierende Enzyme
- modifizierte Histone
- grundlegende Komponenten der Transkriptionsmaschinerie
ChiP-seq
- ChiP-seq = Sequenzierung von Fragmenten der gDNA, die gemeinsam mit dem DNA-bindenden Protein, das untersucht wird, mitpräzipitieren
- Startmaterial: gering (10ng)
- Flexibilität: hoch (genomweiter Assay von jedem sequenzierten Organismus)
- Auslösung: 50bp
- Sensitivität: einstellbar
- Cross-Hybrisation: keine
- 100-fach geringere DNA-Probenmenge - benötigt weniger IP (immuno-precipitation) Reaktionen
- nicht limitiert auf Inhalt, der auf Arrays verfügbar ist (bei ChiP-chip)
- höhere Qualität der Daten auch in komplexen Genomen
- *ChiP-chip**
- ChiP-chip = ChiP kombiniert mit einem DNA-Hybridierungsansatz (chip)
- Startmaterial 4µg
- Flexibilität: limitiert (abhängig von verfügbaren Produkten)
- Auflösung: 500-1000bp
- Sensitivität: schlecht
- Cross-Hybridisation: signifikant
ChiP: Welchen Einfluss hat die Art der Proteine auf den Fixierungsschritt? Beschreiben Sie die anderen Arbeitsschritte von den Zellen ausgehend bis zum angereicherten Chromatin.
Fixierungsschritt: Protein-DNA-Bindungen - fixiert mit Formaldehyd - Proteine müssen in räumlicher Nähe zueinander liegen
Arbeitsschritte
- Fixierung mit Formaldehyd
- Lyse: Freisetzung des Chromatins
- Zerkleinerung des Chromatins durch Ultraschall in Fragmente von einigen 100bp
- jene DNA-Fragmente, die gewünschtes Protein gebunden haben, werden mit dieses Protein spezifischem AK immunopräzipitiert (isoliert)
- isolierte DNA-Protein-Komplexe werden gelöst
- PCR um Sequenz zu amplifizieren
ChiP-seq: Beschreiben Sie die Arbeitsschritte von den Zellen ausgehend bis zur fertigen Chromatinfragmentbank exemplarisch. Erwähnen Sie im Zuge dessen notwendige Kontrollen, Fehlerquellen sowie die Limitierungen der Methode
- Zell-Lyse - Chromatin wird frei
- Chromatin wird fragmentiert und cross-linked
- ChiP: anreichern der gewünschten DNA-Binde-Proteine mit spezifischem AK
- Reparierung und Phosphorylierung der DNA-Fragment-Enden
- a-tailing der DNA
- Ligation des TruSeq Index Adaptors
- Denaturierung und Amplifikation - um Endprodukt für Sequenzierung zu erhalten
Probleme = Limitierung: hochspezifische Antikörper für die untersuchten Proteine finden
Wofür steht die Abkürzung und welche Information kann man mit dieser Methode gewinnen? Nennen Sie die 6 wichtigsten Schritte und erklären Sie was man unter Alignment (welche Limitierung ist damit verbunden bzw. unter “peak calling” versteht?
ChiP-seq
= “Chromatin immunoprecitipitation sequencing”
zur Sequenzierung von Fragmenten genomischer DNA, die gemeinsam mit dem DNA-bindenden Protein ,das untersucht wird, mitpräzipitieren
z.B. Transkriptionsfaktor (TF):
- Identifikation einer DNA-Bindungsstellen im gesamten Genom
- Berechnung der Sequenz des erkannten DNA-Motifs
- Bestimmung der direkten Ziele des TF (Regulon)
- Anhäufung regulatorischer Proteine an spezifische DNA-Stellen
Prozessschritte
- ChiP
- Herstellung einer Chromatinfragmentbank
- Sequenzieren
- **Alignment **→ mit Genom → um Bereiche auf Genom zu identifizieren (Vorsicht, es gibt Regionen die sich wiederholen=
- **Peak-calling **→ um Bereiche im Genpm zu identifizieren, die angereichert sind mit vielen reads, die aligned wurden und für eine spezifische Proteinbindung sprechen. Identifizierung dieser Bereiche mittels speziellen Algorithmen
- Analyse und Visualisierung
DAM-ID - Erklären Sie die Bedeutung der Ablürzung und den Zweck der Methode. Beschreiben Sie kurz die Arbeitsschritte.
DAM-ID = DNA-Adenin-Methyltransferase-Identifikation
→ um Bindestellen von DNA- und Chromatin-bindenden Proteinen in Eukaryoten zu mappen. DAM-ID identifiziert die Bindestellen durch Expression des DNA-bindenden Proteins als → Fusionsprotein mit DNA-Methyltransferase
- Protein wird an die E. coli DAM fusioniert
- Expression in eukaroytischer Zelle
- A: in Nähe der Bindungsstelle methyliert (nur A in GATC-Sequenz wird methyliert)
- Behandlung mit methylierungssensitiven REN (Restriktionsendonukleasen), schneiden nur GATC
- Adapter-Ligation
- (q)PCR
Wie erreicht man durch einen zusätzlichen Schritt, daß ausschließlich Fragmente zwischen direkt aufeinanderfolgenden methylierten Schnittstellen angereichert werden und welche Auflösung ergibt sich, falls dieser zusätzliche Schritt ausgelassen wird?
Verdau der Ligations-Produkte durch DpnII vor PCR. Dieses Enzym schneidet nicht-methylierte GATCs → somit werden nur Fragmente, die von direkt aufeinanderfolgenden methylierten GATCs flankiert sind, amplifiziert.
Auflösung: ca. 200-250bp (Abstand der GATCs)
Vergleichen Sie DAM-ID mit ChiP-seq!
- DNA-Bindungsstellen müssen nicht bekannt sein
- kein Antikörper erforderlich
- Überexpression eines rekombinanten Proteins nötig
- Organismus/Zelllinie muss transformierbar bzw. transfizierbar sein
Weitere Merkmale:
- Auflösung ca. 200-250bp (Abstand der GATCs)
- identifiziert alle Stellen, an denen ein Protein gebunden hat
Erklären Sie Nachteile und Limitierungen der Methode!
- Überexpression eines rekombinanten Proteins nötig
- Organismus/Zelllinie muss transformierbar/transfizierbar sein
- unmöglich, spezifisch posttranslational modifizierte Proteine zu mappen
- nicht möglich für Identifikation von Proteinen, die an DNA entlang gleiten (RNA-Polymerase)
Nennen Sie 2 gegebene Voraussetzungen für den Einsatz in Eukaryoten. Nennen Sie als Beispiel ein Protein, daß sich für diese Methode wenig eignet und warum?
Voraussetzung
- Überexpression eines rekombinanten Proteins notwendig
- Organismus/Zelllinie muss transformierbar bzw. transfizierbar sein
kein Antikörper erforderlich → jedoch: unmöglich, spezifisch posttranslational modifizierte Proteine zu mappen
DAM-ID: stellt nur fest, wo ein Protein war → nicht möglich für Proteine, die an DNA entlang gleiten (RNA-Polymerase)
Erklären Sie die Bedeutung der Abkürzung und den Zweck der Methode. Beschreiben Sie kurz die 4 Arbeitsschritte sowie notwendige Kontrollen und Referenzbedingungen. Erwähnen Sie 2 Unterschiede im Vergleich zur ChFL-Analyse.
CHART-PCR = chromatin accessability real-time PCR, Quanitifizierung der Chromatinzugänglichkeit /-struktur
Arbeitsschritte
- Wachstum der Zellen unter den zu untersuchenden Bedingungen
- Behandlung der Zellen mit Nukleasen (DNase, MNase)
- Isolation genomischer DNA aus behandelten und unbehandelten Zellen
- Quantifizierung mittels qPCR
Kontrolle: Referenzgen → epigenetisch gesilenced
bei CHART-PCR im Vergleich zur ChFL-Analyse
- keine Erzeugung stumpfer Enden und anschließender Phosphorylierung
- kein Nick-Repair
- keine Ligation eines Adapters
- Quantifizierung mittels qPCR
Erklären Sie das Ergebnis der abgebildeten CHART-PCR. Erklären Sie das Ergebnis der abgebildeten Korrelation von CHART-PCR und Genexpressionsanalyse! Nennen Sie zwei Enzyme, die eingesetzt werden und erklären, was damit untersucht wird!
Referenzgen
epigenetisch gesilenced → wird nicht exprimiert → daher egal ob mit oder ohne Behandlung mit Nukleasen kaum US in der amplifizierten SNA, da keine Chromatinzugänglichkeit (stark verdichtet)
Target Gen
konstituitiv exprimiert (dauerhaft exprimiert) unterliegt keiner Regulation → Konzentrations-US von Faktor 8 der amplifizierten DNA (ohne Behandlung mit Nuklease 8x höhere Kopien-Anzahl als bei Behandlung), da die die Nuklease die DNA-Sequenz, die für das Gen codiert, abbaut und somit eine geringere DNA-Templat-Konzentration für die Amplifizierung zur Verfügung steht.
CHART-PCR/Genexpressionanalyse
Konstituitiv eprimierte Gene: die Genexpression ist hoch (dauerhafte Expression, unterliegen keiner Regulation), da die Chromatinstruktur sehr gut zugänglich ist
Epigenetisch regulierte Gene: viele der Gene werde nicht gut oder gar nicht exprimiert, da die Chromatinstruktur sehr schlecht oder gar nicht zugänglich ist und somit die DNA nicht abgelesen werden kann
Enzyme
- DNase: untersucht wird der Verdau der DNA - somit die Zugänglichkeit der DNA für die DNase (= Chromatinzugänglichkeit)
- MNase: micrococcal nuclease = endo-exonuklease - verdaut bevorzugt ssDNA → gibt Aufschluss über die Chromatinstruktur
Erklären Sie die Bedeutung der Abkürzung und den Zweck der Methode. Beschreiben Sie die 8 Arbeitsschritte. Nennen Sie zwei Enzyme, die eingesetzt werden.
ChFL
= chromatin accessability fragment library
erlaubt eine schnelle und exakte Analyse der Chromatinzugänglichkeit unter Verwendung von Stamm- oder konditions-spezifischen Chromatin Fragment Libraries → stellt chromatin accessability fragments des gesamten Genoms dar
Arbeitsschritte
- Verdau durch MNase oder Restritktionsenzym
- enzymatische Erzeugung stumpfer Enden und Phosphorylierung der Enden
- Ligation der Adaptoren A und B (mit Biotin am B-Adapter-Ende) - Fragmente mit allen Aapter-Kombinationen werden gebildet
- nick repair (Reparierung mit Strangbrüchen)
- Biotin-markierte Fragmente (über B-Adaptor) werden spezifisch durch Streptavidin an magnetischen beads erfasst
- Denaturierung, um ssAB-Adapter-Fragment-Library zu erhalten → nur A-B-Adapter-Fragmente
- Isolation + PCR von ssAB-library
- analytische PCR + Fragmentgrößen-Analyse
Enzyme
- MNase: micrococcal nuclease = endo-exonuclease - verdaut bevorzugt ssDNA
- Restriktionsenzym: verdaut DNA an bestimmten Erkennungssequenzen
Erklären Sie die Bedeutung der Abkürzung und den Zweck der Methode. Beschreiben Sie den Ablauf, nennen Sie zwei alternative Analysen zur HRM, nennen Sie zwei andere Methylierungsreaktionen in Verbindung mit DNA.
MS-HRM
= methylation-sensitive high resolution melting, Ziel: methylierte Stellen in der DNA zu identifizieren
- methylierte von unmethylierter DNA unterscheiden
- Bisulfit → reagiert mit unmethylierten Cytosinen (C-U)
- unterschiedliche Schmelzprofile (ursprünglich unmethylierte DNA schmilzt bei niedrigerer Temp.)
- Methylierung bis 0,1% detektieren
Alternativen: TaqMan SNP typing, ARMS-PCR, SNP microarrays, molecular beacons
Methylierungsreaktionen: DNA-Adenin-Methyltransferase-Identifikation, DNA-Methyltransferasen
