Transgene Tiere & Pflanzen Flashcards
Beschreiben Sie die wesentlichsten Schritte der Blattscheiben-Transformation mit Agrobacterium!
- in vitro-Sprosskultur oder Gewächshausmaterial wird sterilisiert
- aus jungen Blätter werden Scheiben geschnitten
- werden für einige Minuten in Agrobacterium-Kultur getaucht
- Blattscheiben werden einige Tage auf festem Medium inkubiert → Übertragung der Bakterien-Zellen in Blattzellen des Wundrandes
- auf Medium zur Doppelselektion: Abtöten der restlichen Agrobakterien und nicht-transgener Blattzellen
- Umsetzen auf Sprossbildungs-Medium
Nennen Sie mindestens acht Eigenschaften/Funktionen, die durch das Herstellen von transgenen Pflanzen verändert oder erreicht werden können?
Herbizidresistenz, Krankheitsresistenz, Stresstoleranz, Stickstoff-Metabolismus, Ertrag, Qualitätsverbesserung, männliche Sterilität, neuartige Ernteprodukte, Blütenfarbe, Pflanzen aus Bioreaktoren
Welche 4 Hauptmethoden zur Transformation von Pflanzen kennen Sie?
- Agrobacterium tumefaciens
- particle gun (Scutellum, Pollenschlauch)
- Protoplasten-Transformation = plasmatischer Inhalt einer Zelle bei Zellen mit Zellwand (Elektroporation, Mikroinjektion, Polyethylenglykol)
- **Plastidentransformation **(z.B. Chloroplasten)
Was versteht man unter Ti Plasmiden, erklären Sie deren Funktionsweis am Beispiel von pBin19!
Ti-Plasmid (tumor-inducing plasmid): kommen häufig in Agrobacterium tumefaciens und A. rhizogenes vor
- T-Plasmid mit T-Region: in A. tumefaciens
- T-Plasmid wird in Pflanzenzelle eingeschleust
- Synthese einer ssT-DNA → Integration ins Wirtsgenom → tumorartige Wucherungen
Gentechnische Anwendung: Gene für Tumorbildung → durch gewünschte Gene ersetzt (z.B. Gen-Mais, Anti-Matsch-Tomate)
pBin19-Ti-Plasmid:
- Replikationsursprung für E. coli und Agrobacterium (pBin19 in E. coli modifiziert)
- Selektionsmarker für Pflanzen und Bakterien
- T-DNA: in Pflanzenzelle übertragbar, umgeben von left border und right border
- T-Region: lacZ-Bereich mit MCS → rekombinante Klone: Blau/weiß-Screening
- Transfer- bzw. tra-Gene, Virulenz bzw. vir-Gene (notwendig für DNA-Transfer in Pflanzenzelle)
entwaffnetes T-Plasmid: Vektorsystem → gewünschte Gene zwischen LB und RB
Was versteht man unter einem binären Vektorsystem, skizzieren Sie eine Pflanzentransformation mit einem derartigen System!
2 Plasmide in Agrobacterium:
- entwaffnetes Ti-Plasmid (T-DNA-Region entfernt), trägt vir-Region = Vir-Helfer-Plasmid. Vir-Region für Übertragung der T-DNA zuständig
- Ti-Plasmid (pAM194) mit insertiertem Target-Gen in T-DNA-Region: modifizierter T-DNA-Bereich auf kleinem Plasmid (20kb, ohne vir-Gene). Vermehrung in E. coli und Agrobacterium möglich, in E. coli Insertion von Fremd-Gen in T-DNA
Übertragung des Ti-Plasmids mit Fremd-Gen in Agrobacterium (Elektroporation) → Vir-Helfer-Plasmid überträgt T-DNA mit Fremd-Gen des in E. coli hergestellten Plasmids in Genom der Pflanzenzelle
Beschreiben Sie die einzelnen Schritte einer Protoplasten-Transformation bei Pflanzen, welche Möglichkeiten kennen Sie, um DNA in Protoplasten einzuschleusen?
- embryogene Suspensionskulturen aus: unreifen Embryonen, reifen Embryonen, Mikrosporenkulturen
- Protoplastengewinnung
- DNA-Aufnahme: Elektroporation, PEG, Mikroinjektion
- Kalluswachstum
- Selektion(z.B. Kanamycin)
4. Sprossinduktion
5. Regeneration ganzer Pflanzen
Erklären Sie die Methode des “Gene Silencings” durch Transposonaktivtität, wie können so Genloci identifiziert werden?
Gene Silencing: Gene aktiv abschalten, dient der **Genregulation **→ durch Hemmung der Transkription von DNA auf mRNA oder der Translation.
Transposon = beweglicher DNA-Abschnitt, kann stressbedingt “springen”
Integration von Transposon in ein Gen → keine Transkription (mRNA-Abbruch - kein Protein)
Identifizieren von Genloci: physische Position eines Gens im Genom
- Mutation findet statt, wenn ein Transposon in ein Gen integriert wird → Allele können untersucht werden
- Mutation → kann Funktionalität des Gens beeinträchtigen → Identifizierung von Genen, die wichtig sind für Funktion der Zelle bzw. Gene, die Funktion anderer Gene beeinflussen
Erklären Sie die Methode des “Gene Silencings” durch RNA-Interferenz!
Zielgerichtetes “Gene Silencing” - natürliches Mechanismus in Eukaryoten
Gentechnik:
- dsRNA wird eingebracht und vom Dicer in kurze dsRNA-Abschnitte gespalten
- es erfolgt eine Spaltung in ssRNA, ein Leitstrang wird in den RISC-Komplex (RNA-induced silencing complex) aufgenommen
- der RISC wird aktiviert, um mRNA zu spalten, die komplementär zum Leitstrang ist
- mRNA wird abgebaut, es erfolgt keine Translation
Leitstrang bestimmt, welche mRNA abgebaut wird.
Welche gentechnisch erzeugten Resistenzen kennen Sie, nennen Sie Beispiele!
Virusresistenz
- Expression viraler Hüllproteine (coat protein-mediated resistance)
- Expression viraler movement-Proteine
- Expression viraler Satelliten-RNA
- Ribozyme
Insektenresistenz
- Bacillus thuringiensis-Toxin
- Protease-Inhibitoren
- alpha-Amylase-Inhibitoren
- Ribosomen-inaktivierende Proteine
Pilzresistenz
- Chitinasen
- Glucanasen
- RNasen (BARSTAR) und pathogen-induzierte Promotoren
- Phytoalexingene (Resveratrol)
Bakterienresistenz
- Lysozym
- Pektatlyase
Nematodenresistenz
- Kombination von Selbstmordgenen (RNasen) mit Syncytien-spezifischen Promotoren
- Antikörper gegen Nematodenspeichel
Welche Beispiele für gentechnisch erzeugte Verbesserungen der Nahrungsmittelqualität kennen Sie (nennen Sie mindestens 8)!
- Fettsäurezusammensetzung
- Speicherproteine (Lysin-reiche Speicherproteine)
- Speicherstärke (Amylose-freie Kartoffeln)
- freie Aminosäuren (feedback-insensitive DHDPS- und AK-Enzyme)
- Mikronährstoffe (Ca, Fe, J, Se) - erhöhter Fe-Gehalt: Phytase, Ferritin
- Vitamine (erhöhter Carotin-Gehalt)
- Insulin (Zuckerrübe)
- Phytase (verbesserter Aufschluss von Phytinsäure
Nennen Sie Beispiele für den Einsatz von Pflanzen als Bioreaktoren!
- Technische Enzyme: alpha-Amylasen, Glucanase, Ligninperoxidase, Xylanase
- Hühner-Avidin
- Essbare Impfstoffe: Antikörper (AK gegen Kariesbakterien aus Tabak), Antigen (E. coli Enterotoxin in Kartoffeln, Hepatitis B Oberflächen-Antigen in Kartoffeln
Welche drei Grundstrategien zur Herstellung transgener Tiere werden angewandt, welche drei DNA-Einschleusetechniken werden verwendet?
Grundstrategien:
- Gene replacement (nur mutant gene aktiv)
- Gene knock-out (kein aktives Gen da)
- Gene addition (beide Gene sind aktiv)
DNA-Einschleusetechniken
- DNA-Mikroinjektion in befruchtete Eizelle
- Injektion von genetisch veränderten embryonalen Stammzellen in Blastozyten
- retroviraler Gentransfer in Embryonen im 4- oder 16-Zellstadium
Welche Faktoren beeinflussen den Genotyp bzw. Phänotyp von transgenen Tieren, zeichnen Sie ein Wirkdiagramm!
Genetische Faktoren bestimmen
→ direkte Wirkung (Mutation)
→ indirekte Wirkung (genet. Hintergrund) → wirkt sich auf Genotyp aus
Direkte Wirkung
→ Integrationsstelle (Positionseffekte)
→ Anzahl Kopien
→ Struktur des Transgens
wirken sich alle 3 auf den Genotyp aus. Nur nicht-genetische Faktoren wirken direkt auf den Phänotyp.
Erklären Sie das Prinzip des Cre/Lox-Systems!
Cre/Lox-System: für konditionale knock-outs
Stammt aus Bakteriophagen P1; sequenz- oder locus-spezifische Rekombinase Cre führt zu ortsspezifischer Rekombination von DNA, die von loxP-Elementen flankiert wird (Cre = cause recombination, loxP = locus of crossing over - x)
→ gezieltes Entfernen von DNA-Sequenzen in lebenden Organismen, z.B. genetische Modifikation einzelner spezifischer Zell- oder Gewebearten
Vorgang
Man setzt vor und hinter den DNA-Abschnitt, der entfernt werden soll, eine loxP-Stelle (“floxen”), Cre-Enzym erkennt und verbindet loxP-Stellen → schneidet DNA-Sequenz heraus. Der dabei entstandene kurze, ringförmige DNA-Abschnitt wird in der Zelle abgebaut
Was versteht man unter Klonen?
Der Zellkern eine unbefruchteten Eizelle wird entfernt und durch den Kern einer somatischen Spenderzelle ersetzt.
Ei wird einer Leihmutter eingesetzt.
