Das genetische Handwerkszeug Flashcards
Benennen und beschreiben sie die 3 Typen von Restriktionsenzymen. Gehen sie bei Typ II im Speziellen auf die Begriffe: Erkennungssequenz, Schnittstelle und Schnitt-Ende sowie auf Isoschizomere und Neoschizomere ein?
Restriktionsenzyme = Restriktionsendonucleasen:
schneiden DNA an def. Stellen (Erkennungssequenzen) = Abwehrmechanismus für Fremd-DNA
Typ I-Restriktionsenzyme:
- bestehen aus 3 Untereinheiten:
S - Untereinheit: erkennt die DNA Sequenz
M - Untereinheit: methyliert die DNA
R - Untereinheit: schneidet die DNA
- trifft das Enzym auf unmethylierte DNA schneidet es an zufälligen Stellen
- Hemimethylierte DNA (nach Replikation) wird methyliert
- eingeschränkte Verwendung in der Molekularbiologie
Typ II-Restriktionsenzyme: Standard
- schneiden DNA innerhalb spezifischer Sequenzen (4-8 bp lang, 4-, 6- bzw. 8-cutter)
- Erkennungsstellen à meist Palindrome
- in 25% aller untersuchten Bakterienstämmen vorhanden, meist 1 – 2 (max. 6)
- besteht aus 2 unabhängigen Proteinen: Methylase: methyliert hemimethylierte DNA
Restriktionsenzym: schneidet unmethylierte DNA
- Beispiele: EcoRI, BamHI
- Erkennungssequenz – EcoRI: 5‘-GAATTC-3‘
- Schnittstelle – EcoRI: 5‘ G*AATT C 3‘
3‘ C TTAA\* G 5‘
- Schnitt-Enden – EcoRI: überstehendes 5‘ Ende (auch noch: glatte, überstehende 3’Enden)
Enzyme à die gleiche Sequenz erkennen:
- Isoschizomere: schneiden auch an der gleichen Stelle
- Neoschizomere: schneiden an anderer Stelle
Typ III-Restriktionsenzyme:
- Bestehen aus mehreren Unterheinheiten
- Erkennen spezifische Sequenzen à schneiden DNA aber 20 – 25 Nukleotide entfernt
- Derzeit 5 Typ – III – Restriktionsenzyme charakterisiert
- Geringe Bedeutung in der Molekularbiologie
Beschreiben sie die wesentlichsten Charakteristika von bzw. Unterschiede zwischen Typ I, II und III Restriktionsenzymen.
Aufbau:
à Typ I und III bilden einen Komplex (ein Enzym) aus mehreren Untereinheiten
à Typ II besteht aus 2 unabhängigen Enzymen (Methylase + Restriktionsenzym)
Schnittstellen:
à Typ I: zufällig
à Typ II: innerhalb spezifischen Sequenz
à Typ III: 20-25 bp von Erkennungssequenz entfernt
Erkennungssequenzen:
à Typ II: Palindrome
à Typ I: asymmetrisch
Wie ist 1 Unit bei Restriktionsenzymen definiert, was versteht man unter den Qualitätskriterien „Overdigestion Assay“ und „Ligation Assay“?
1 Unit = Menge an Enzym, die 1µg DNA in 60 min bei korrekter Temperatur (37°C) im korrekten
Puffer in einem 50 µl Ansatz vollständig schneidet. Substrat-DNA abhängig!
„Overdigestion Assay“:
Substrat-DNA wird für 16 h mit unterschiedlichen Enzymmengen verdaut
Elektrophorese: welche Enzymmenge liefert noch scharfe Banden?
Auskunft über Kontamination mit nicht spezifischen Endo- oder Exonukleasen
„Ligation Assay“:
Substrat-DNA wird vollständig verdaut, re-ligiert (Ligase) und mit gl. Restriktionsenzym wieder verdaut Menge an nicht re-ligiertem Fragment: Auskunft über Kontamination mit Phosphatasen und Exonukleasen Menge an nicht wiederschneidbaren Ligationsprodukten: Auskunft über Kontamination mit Exonukleasen
Welche in der Gentechnik verwendeten Nukleasen kennen sie, welche Aktivitäten weisen sie auf und wozu werden sie verwendet?
Nukleasen: brechen Phosphodieseterbindungen auf und bauen damit Nukleinsäuren ab
-) Restriktionsendonukleasen: Typ I, II und III
Aktivitäten: schneiden unmethylierte DNA und bauen sie ab (z.B. Fremd-DNA)
Aktivität: in Units gemessen
Anwendung: Insertion von Genen in Vektoren; Verdau von PCR Produkten
-) Bal 31 Exonuklease: schnelle 3’ Exonuklease, langsame Endonuklease
Verwendung: baut in hohen Konzentrationen ein DNA-Molekül effektiv von beiden Seiten her ab
- ) EXO III: erzeugt DNA Moleküle mit überhängenden 5’ Enden
- ) DNase I (Desoxyribonuklease I): spezifisch für DNA, schneidet zufällig dsDNA und ssDNA
Verwendung: DNA-Abschnitte mappen um Zugänglichkeit zu sehen; RNA-Reinigung
-) S1-Nuklease: schneidet zufällig innerhalb ssDNA und ssRNA
Verwendung: Reinigung (Entfernung von ssDNA und ssRNA)
-) RNase I: verdaut ssRNA
Verwendung: zur Entfernung von RNA aus DNA-Präparationen**; **
Identifikation von Mutationen ein DNA-RNA Hybridstrang wird an „mismatch“ Stellen geschnitten
Welche in der Gentechnik verwendeten DNA Polymerasen kennen sie, welche Aktivitäten weisen sie auf und wozu werden sie verwendet?
- ) DNA abhängige DNA-Polymerase: erstellt einen DNA-Strang von einer DNA-Matrize
- ) RNA abhängige DNA-Polymerase: erstellt von RNA eine DNA-Kopie (Umkehrfluss genet. Info)
- ) DNA abhängige RNA-Polymerase: erstellt von DNA eine RNA-Kopie
Polymerasen: synthetisieren Nukleinsäuren
- verknüpfen Nukleotide, deren Abfolge komplementär zu einer Matrize ist
- Synthese erfolgt in 5´à3´ Richtung
- hinzugefügte Nukleotide benötigen eine freie 3´- OH-Gruppe
- Synthese kann nur an einem kurzen doppelsträngigen Bereich (Primer) starten
a) DNA-Polymerase I / Klenow-Fragment:
Aktivitäten: 5’à3’ Exonuklease (DNA Pol I)
3’à5’ Exonuklease (DNA Pol I, Klenow Fragment) …für Proofreading
5’à3’ Polymerase (DNA Pol I, Klenow Fragment)
Anwendung:
- Synthese einer ds DNA auf einer ssDNA-Vorlage
- Auffüllen von zurückgesetzten 3’Enden einer dsDNA (5‘à3‘ Polymerase-Aktivität)
- Abbau von 3‘ überhängenden Enden einer dsDNA (3‘à5‘ Exonuklease-Aktivität)
b) T4 DNA Polymerase: aus Bakteriophage T4
Aktivität: 3’à5’ Exonuklease (200x höher als Klenow Fragment)
5’à 3’ Polymerase
Anwendung: Ideal für Abbau 3’ überhängender Enden von ds-DNA à höchste Proofreadingaktivität!!
c) T7 DNA Polymerase: aus Bakteriophage T7
Aktivität: 3’à5’ Exonuklease (200x höher als Klenow Fragment)
5’à 3’ Polymerase
Anwendung: Sequenzieren nach Sanger (Polymerase hat hohe Prozessivität)
d) Thermostabile DNA Polymerasen:
Taq (keine 3‘à5‘ Exonuklease!), Pfu, Vent, Stoffel,…Anwendung: PCR, da hitzestabil
e) Reverse Transkriptase:
Aktivitäten: DNA Polymerase von ssRNA; isoliert aus Retroviren; mRNA à cDNA (bereits gespliced, dh. keine Introns, kann von Bakterien ausgelesen werden)
Anwendung: zB. Produktion von Insulin in Bakterien
Welche in der Gentechnik verwendeten RNA Polymerasen kennen sie, welche Aktivitäten weisen sie auf und wozu werden sie verwendet?
Benannt nach den für sie codierenden Bakeriophagen (T7 RNA -, T3 RNA-, SP6 RNA Polymerase)
Aktivitäten: 5´à3´ Polymerase
KEINE 3´à5´ Exonuclease (keine Proofreadingaktivität!!)
Anwendung: in vitro Transkription zur Herstellung definierter RNAs
Antisense-RNA: zur Ausschaltung der Expression von bestimmten Genen
Wozu wird Alkalische Phosphatase verwendet, welche Arten kennen sie, was sind deren spezifische Charakteristika?
Anwendung: AP à Hydrolyse von Phosphorsäureestern
Entfernen von 5’ Phosphatenden von geschnittenen Vektoren, verhindern re-ligieren der Vektoren
Entfernen von 5´Phosphatenden von DNA Fragmenten zu deren nachträglicher Endmarkierung
Arten:
Bakterielle AP(BAP): höchste Aktivität, schwer zu inaktivieren
AP aus Rinderdarm (CIAP): hitzeinaktivierbar 75°C, 10min mit 5mM EDTA
AP aus Schrimp: hitzeinaktivierbar bei 65°C, 15min
Welche Aktivität haben Polynukleotidkinasen, welche Reaktionsmechanismen kennensie?
T4 Polynekleotidkinase:
katalysiert den Transfer von Phosphat von ATP auf die 5’ Enden eines Polynukleotidstranges
2 Reaktionsarten:
- Forward Reaction
- Exchange Reaction (schneide + wieder Anheft-Wirkung)
Welche Aktivität hat die DNA Ligase, wie verläuft der Reaktionsmechanismus?
T4 DNA-Ligase:
verbindet kovalent DNA-Enden (5’ phosphorylierte Enden mit 3’OH-Enden)
à ATP abhängige Reaktion!!
Mechanismus:
1: Sticky ends werden zuerst annealed
2: Ligase bindet 5’ und 3’ Enden kovalent
Units hoch halten (Enzym überdosiert), [ATP] einstellen, temperaturabhängig legieren
