Klonierungsmethoden Flashcards
Was verstehnt ma unter einem EcoRI Linker/Methylase-Klonierungssystem? Geben Sie Beispiele für die Anwendung!
EcoRI Linker
- Synthetisierte DNA-Sequenzen tragen Schnittstellen für EcoRI
- werden an den stumpfen Ende der zu insertierenden DNA aligniert
- nach Restriktionsverdau entstehen klebrige Enden → dsDNA wird mit Vektor aligniert
EcoRI-Methylase:
cDNA wird an EcoRI Erkennungssequenz methyliert → Schutz vor Restriktionsschnitten
Zur cDNA-Klonierung in Bakteriophagenvektoren
Wie erfolgt die Herstellung von cDNA, welche Komponenten sind notwendig, welche Alternativen zum Standard-Protokoll kennen Sie?
- Anlagerung der oligo(dT)Primer an den Poly-A-Schwanz der mRNA
- reverse Transkriptase synthetisiert cDNA
- Denaturierung mittels NaOH (alternativ mittels RNase), offenes OH-Ende klappt zurück (alternativ: Linker-DNA)
- ds-cDNA mittels DNA-Polymerase/Klenow-Fragment
- Verdau mit S1-Nuklease
Alternative: Zweistrangsynthese über Oligo(dG)Primer
- cDNA-Synthese nach mRNA-Vorlage
- terminale Transferase und dCTP erzeugen Homopolymerschwanz
- Denaturierung mittels alkalischem Saccharosegradient
- Anlagerung des Oligo(dG)Primers → DNA-Polymerase → ds c-DNA
Welche Möglichkeiten der cDNA-Klonierung kennen Sie? Gehen Sie auf Vor- und Nachteile der Techniken ein!
Ligation glatter Enden:
- VT: schnell, einfch
- NT: geringe Ausbeute, keine Restriktionsschnittstellen
Ankoppeln von Homopolymerschwänzen:
- VT: relativ hohe Ausbeute
- NT: keine Restriktionsschnittstellen
Einsatz von Linker-Molekülen und Adaptoren:
- VT: relativ hohe Ausbeute, es entstehen Restriktionsschnittstellen
Was ist eine Genom-Bank, wie kann berechnet werden, wie viele Klone einer Genbank ein Genom mit einer bestimmten Wahrscheinlichkeit repräsentieren?
Eine Genom-Bank beinhaltet das gesamte Genom eines Organismus in Form von definierten DNA-Fragmenten auf Vektoren in Phagen oder Bakterien (dienen der Speicherung und der Vervielfältigung der Fragmente).
Wie viele Klone repräsentieren ein Genom?
N = ln (1 - P ) / ln ( 1- a/b)
N…Anzahl der benötigten Klone
P…Wahrscheinlichkeit, mit der ein Klon vertreten sein soll (0,95 bis 0,99)
a. ..durchschnittliche Fragmentgröße
b. ..Genomgröße
Beispiel: E. coli P = 0,95; a = 20kb; b = 4*103kb → N = 6*102 Klone benötigt
Welche Schritte sind notwendig, um eine Genom-Bank eines Organismus herzustellen? Erklären die die Vorgehensweise, um eine Lambda-Genom-Bank herzustellen!
- Isolierung von genomischer DNA aus einem lambda-Phagen
- Verdau der DNA mit Restriktionsenzymen
- jedes Fragment wird separat über einen Vektor (Plasmid) in den Wirt (E. coli) enigebracht → Zielgen ist konserviert
- Wirt vervielfältigt eingefügtes DNA-Fragment und bildet Kolonien
- es werden soviele Kolonien erzeugt, um das gesamte Genom des lambda-Phagen zu präsentieren
Größe der Fragmente hängt vom Vektor ab: Plasmid - Phagemid - Phage - Cosmid - BAC - YAC
Was versteht man unter “Partial Fill In” Klonierung, erklären Sie die Vorgehensweis anhand zweier Restriktionsenzyme ihrer Wahl!
Wenn kein passender 4-Basen-Überhang vorhanden ist, um zu ligieren, kann man an einem kleineren 2-Basen-Überhang die Enden auffüllen, bis sie kompatibel sind.
Beispiele: XbaI und HindIII
Skizzieren Sie die cDNA-Klonierung nach Okayama & Berg!
Plasmidvektor fungiert direkt als Primer für die cDNA-Synthese → E. coli-Klon, der ein Stück cDNA enthält + Promotor davor.
Welche Klonierungssysteme durch Rekombination kennen Sie, worauf beruhen Sie?
z.B. Rekombinasesystem des lambda-Phagen, Cre-Rekombinasesystem des P1-Phagen
- eine Rekombinase sorgt für die Rekombination von 2 DNA-Fragmenten
- erfolgt an spezifischen Erkennungsstellen der DNA
- Erkennungsstellen müssen an beiden Strängen vorhanden sein
→ Echo-, Creator-, Getway-System
Erklären Sie die Klonierungsstrategie des “Echo-Systems”!
- Donor und Akzeptor besitzen je eine loxP-Erkennungssequenz (für P1-Rekombinase, Cre)
- Vektoren können als Fusion co-existieren (da ORIs unterschiedlich)
- Akzeptor trägt alle für Expression in best. Systemen notwendigen Elemente
Erklären Sie die Klonierungsstrategie des “Creator-Systems”!
- Donor besitzt 2 loxP-Erkennungsstellen (P1-Rekombinase Cre) Cmr und SacB-Gen
- Cmr wird bei Rekombination mittransferiert = Selektionsmethode
- SacB verhindert Wachstum von gramnegativen Bakterien bei 5% Saccharose (Überimpfen des Transformanten auf 5%-Saccharose-Medium)
Erklären Sie die Klonierungsstrategie des “Getway-Systems”!
- Donor und Akzeptor besitzen je zwei att Erkennungssequenzen (für Rekombinasesystem des lambda-Phagen)
- werden auf spezifische Weis miteinander rekombiniert (attP x attB, attL x attR)
- Akzeptor besitzt Killergen ccdB → wird bei Rekombination mit cDNA des Donors getauscht
