PCR-Methoden Flashcards
Was versteht man unter 5’-RACE-PCR? Zeichnen Sie ein Schema der einzeln ablaufenden Schritte, benennen Sie die beteiligten nukleinsäure-modifizierenden Enzyme und deren Funktionen!
RACE-PCR = rapid amplification of cDNA-ends with polymerase chain reaction
Technik zur schnellen Vervielfältigung von cDNA-Enden mit Hilfe der PCR → Abwandlung der RT-PCT, Ziel: Isolierung von Genenden
- Synthese des 1. cDNA-Stranges mit genspezifischem Primer (PSP1) und Reverser Transkriptase
- Entfernung überschüssiger RT, GSP1 und dNTPs
- Denaturierung (Abbau der mRNA mit RNase H), Anlagerung des (dT)17-Adapters (2 Ankerprimer + Oligo(dT) → Verlängerung mit Taq-Polymerase
- Denaturierung, Anlagerung des GSP2- und R1-Primers → PCR
- zweite PCR mit GSP3 und R2
Welche Taq-Polymerase kennen Sie, was sind deren wichtigste Eigenschaften, welche Anwendungen ergeben sich daraus?
Amplitaq/Taq-Polymerase:
- aus Bakterium Thermus aquaticus
- Temperatur: 70-80°C, 35-100 Nukleotide/sec
- 5’→3’ Exoukleaseaktivität
- keine 3’→5’ Exonukleaseaktivität (kein Proofreading)
- Amplitaq: gentechnisch veränderte Polymerase
- Amplitaq LD (low DNA)
- am schnellsten, jedoch auch die meisten Fehler
Amplitaq/Stoffel-Fragment:
- aus Bakterium Thermus aquaticus
- Temperatur: 70-80°C, 35-100 Nukleotide/sec
- keine 5’→3’ Exonukleaseaktivität
- keine 3’→5’ Exonukleaseaktivtität
- Aktivität über großen Mg2+-Konzentrationsbereich
- Anwendung: G/C-reich Regionen, DNA Sekundärstrukturen, Vervielfältigung zirkulärer DNA, Multiplex-PCR (Mg2+-Bereich)
Welche wesentlichen Grundregeln sind bei einem PCR-Primer-Design zu beachten?
- Länge: 20-30bp
- Basenkomposition: ideal 25% A/T/G/C, G/C < 75%, keine Purin- oder Pyrimidinstretches, keine 3’-intra- oder intermolekular kompatiblen Strukturen
- Mutagenese-Primer: Mutation in der Mitte
- Restriktionsschnittstellen, GC-Klammern: am 5’-Ende
Erläutern Sie anhand eines konkreten Beispiels (einer konkreten Aminosäuresequenz) das Design von degenerierten Primers, wie kann der Degenerierungsgrad reduziert werden?
Degenerierte Primer: Gemisch aus ähnlichen Primer-Sequenzen → in degeneriertem Code zusammengefasst. Anwendung: um homologe Gene (in verschiedenen Spezies) mit einem Primer-Paar zu amplifizieren → für 1 Proteinsequenz → viele verschiedene codierende DNA-Sequenzen möglich
AS-Sequenz: Ala Lys Trp Ala
Unterschiedliche Codons der AS: GCAAAATGGGCA
G G G
C C
T T
Anzahl der Möglichkeiten 4 x 2 x 1 x 4
= Degenerierungsgrad 32
Verminderung des Degenerierungsgrads durch Isosin als Degenerationsbase
AS-Sequenz: Ala Lys Trp Ala
Unterschiedliche Codons der AS: GCI AAA TGG GCI
G
= Degenerierungsgrad 2
Wie wird für einen 25 bis 35 Basen langen Primer doe Schmelztemperatur berechnet?
Tm = 81,5°C - 16,6 (log10[J+]) + 0,41 (%G+C) - 0,63 (%Formamid) - 600/L
J+…Konzentrationen monovalenter Kationen
L…Länge des Primers
Tm…Temperatur, bei der die Hälfte der Nukleotide dissoziiert ist
Welche Markierungstechniken von Primern kennen Sie?
a) Radioaktive Markierung: 32P-ATP + T4-Polynukleotidkinase
- Sequenzieren nach Maxam Gilbert
- DNA-Footprinting, LM-PCR (linker/ligation-mediated)
b) nicht-radioaktive Markierung
Biotinmarkierung am 5’-Ende
- nicht-radioaktiver Nachweis, Qunaitifizierung
- Makrierung während der Synthese über Biotin-Phosphoramiditen
Fluoreszenzmarkierung
- Markierung während der Synthese über Fluoreszin-Phophoramiditen
- Nachweis mehrerer Amplikons gleicher Größe durch unterschiedliche Fluoreszenzfarbstoffe
Markierung durch Fluoreszenzfarbstoffe (z.B. aktive Ester)
- Kopplung nach der Synthese
- Kopplung über Amino-Phosphoramidit (“Aminolink”)
Markierung als “enzymatisches Oligonukleotid” (z.B. alkalische Phosphatase)
- Kopplung über Aminolink → meist als Sonden in Verwendung
Beschreiben Sie die SPA-Methode zum Nachweis von PCR-Produkten, worin besteht der Unterschied zwischen der “total-“ und der “specific amplimer method”?
SPA (Scintillation proximity assay): Messung der Emission von Photonen beim radioaktiven Zerfall mittels Photomultiplier eines Scintillationsdetektors.
SPA-Kügelchen (beads) → emittieren bei Interaktion mit radioaktiv markierten PCR-Produkten Licht (binden an die Oberfläche der beads)
Total amplimer method:
- PCR-Produkt (mit 3H markierte Nukleotide), Biotin-markierter Primer
- SPA-beads (fluoromicrosphere) → mit Streptavidin an Oberfläche → Biotin bindet an Streptavidin
- radioaktive Strahlung wird auf beads übertragen → Licht wird emittiert
Specific amplimer method:
- PCR Produkt (mit 3H markierte Nukleotide), unmarkierte Primer → Denaturierung
- Sonde mit Biotin markiert → bindet spezifisch an der Sequenz, die nachgewiesen werden soll
- Biotin bindet an Streptavidin, usw.
Beschreiben Sie die ECL-Methode zum Nachweis von PCR-Produkten, worin besteht der Unterschied zwischen der “unspezifischen” und der “spezifischen” Methode?
ECL (Elektrochemoluminszenz-Methode): Oligonukleotide werden während der Synthese mit Tris-(2,2-bispyridin)-Ruthenium(II)-Chelat (TBR) verknüpft → durch Anlegen einer Spannung emittiert Ruthenium Licht.
unspezifisch:
- paramagnetische Partikel mit Streptavidin an der Oberfläche
- Oligonukleotide werden während der Synthese mit TBR verknüpft
- Biotin-markierter Primer bindet an Streptavidin
- Magnet → zieht Partikel an → Anlegen einer Spannung → TBR Emission von Licht
spezifisch:
- PCR-Produkt mit unmarkiertem Primer
- Denaturierung
- Sonde mit Biotin markiert, bindet an die Sequenz, die nachgewiesen werden soll
- Biotin (Sonde) bindet an Streptavidin
Welche Methoden zur Vermeidung von Kontaminationen von PCRs kennen Sie?
a) Uracil-N-Glykosylase
- Verwendung von dUTPs statt dTTPs om PCR
- Amplikons: Uracil → werden durch Urail-N-Glykosylase hydrolysiert
- schließt Kontamination durch PCR aus
b) UV-Strahlung, abhängig von
- Pyrimidingehalt
- Länge der kopierten DNA
- gelöste oder trockene DNA
- Bestrahlungszeit, Entfernung von UV-Quelle, Wellenlänge, Energie
c) Behandlung mit Enzymen, Verunreinigung mit DNA
- DNase
- Exonuklease III
- Restriktionsenzyme
jedoch: zusätzliche Schritte → neue Kontaminationsquellen
d) Behandlung mit Psoralen
- bilden unter Einwirkung von langwelligem UV-Licht Monoadukte mit dsSNA
- Zusetzen zu PCR, nach Amplifikation photoaktivieren, Einbau von Psoralen schädigt DNA, Polymerasen sind blockiert, keine Übertragung in eine neue Reaktionen, z.B. 4’-Aminomethyl-4,5’-Dimethylisopsoralen (4’-AMDMIP)
Skizzieren Sie das Prinzip der verschachtelten PCR!
Nested PCR: es werden statt einem 2 Primerpaare eingesetzt, aber nur bei sehr geringen DNA-Mengen
- PCR mittels externen Primern → Produkt als template für
- zweite PCR, Primer innerhalb des ersten PCR-Produkts
Erklären Sie das Prinzip der PCR-Klonierung mittels Einfügen von Restriktionsschnittstellen!
- in PCR-Primern benutzte Restriktionsschnittstellen → können auch innerhalb der amplifizierten Fragmente vorhanden sein
- Restriktionsschnittstellen, die die Primer in Kopien einfügen → lassen sich oft nur schneiden, wenn man zusätzliche Nukleotide an das 5’-Ende anhängt
- wenn Restriktionsenzyme (z.B. EcoRI) nicht im gleichen Puffer aktiv sind, muss man eine Restriktionsspaltung nach der anderen durchführen
Skizzieren Sie das Prinzip der A/T-Klonierung von PCR-Produkten, welche DNA-modifizierenden Enzyme sind beteiligt?
Ziel-DNA: Denaturierung und Primeranlagerung → PCR mittels Taq-Polymerase → 3’-A-überhängende Enden
Vektor-DNA: Restriktionsschnitt mit HaeIII, HpaI oder SmaI → glatte Enden, Anhängen eines / an den 3’-Enden mittels Terminaltransferase
→ Ligation von Vektor-DNA und Amplikon
Was versteht man unter PCR-Produkt-Klonierung mittels LIC?
LIC (ligation independent cloning):
= Klonierung → ohne Restirktionsenzyme und Ligasen, Anwendung: Klonierung von Genen mit Restriktionsschnittstellen
- Herstellen von PCR-Produkten mit ca. 12bp langem 5’-Überhang (mittels Primer eingefügt)
- Vektor-DNA: durch PCR werden ebenfalls 5’-Überhänge erzeugt (komplementär)
→ Hybridisierung der beiden Amplikons und Transformation in E. coli
Was versteht man unter 3’-RACE-PCR, zeichnen Sie ein Schema der einzeln ablaufenden Schritte, benennen Sie die beteiligten nukleinsäure-modifizierenden Enzyme und deren Funktion!
RACE-PCR = rapid amplification of cDNA-ends with polymerase chain reaction, Technik zur schnellen Vervielfältigung von cDNA-Enden mittels PCR, Ziel: Isolierung von Gen-Enden
- Synthese des 1. cDNA-Strangs ausgehend von mRNA mit Oligo(dT)-Primer (Ankerprimer R1+R2 stehen 5’ über) und Reverser Transkriptase
- Denaturierung und Abbau der mRNA mittels RNase H, Anlagerung des GSP1-Primers und R1-Primers → Verlängerung mittels Taq-Polymerase
- Denaturierung und Anlagerung des GSP1- und R1-Primers → anschließend PCR
- zweite PCR mit GSP2 und R2
Was versteht man unter LM-PCR, zeichnen Sie ein Schema!
LM-PCR (linker-mediated/ligation-mediated PCR):
um direkt genom. DNA zu sequenzieren, falls Primer für interessante Region vorhanden sind → Verwendung von kleinen DNA-Linkern, die mit DNA ligieren und Primer, die sich an DNA-Linker anheften
- Synthese des ersten cDNA-Strangs mit GSP1 und Reverser Transkriptase
- Entfernen überschüssiger Primer und mRNA Hydrolyse mit NaOH
- Ligation des Ankeroligonukleotids (=Linker) an den ersten cDNA-Strang mit T4-RNA-Ligase
- PCR mit Ankerprimer und GSP2
- zweite PCR mit Ankerprimer und GSP3
Was versteht man unter E-PCR, zeichen Sie ein Schema!
Schnelle und einfache Methode für die in vitro-Produktion von Proteinen ohne Klonierung. → beruht auf der Einbringung aller für die Transkription und Translation benötigter Elemente ohne Klonierung
Was versteht an unter SOE-PCR, zeichnen Sie ein Schema!
SOE-PCR (splicing by overlap extension):
→ zur Verknüpfung von PCR-Produkten (z.B. Fusion von 2 Genen), chimäre DNA um neues Protein zu schaffen
→ um Mutationen an bestimmten Punkten in einer Sequenz einzubringen
→ um kleinere DNA-Fragmente zu einem größeren Polynukleotid zu spleißen
Um 2 DNA-Moleküle zu spleißen, werden spezielle Primer an denjenigen Enden verwendet, die später zusammengefügt werden sollen, für jedes der beiden Moleküle wird der Primer so konstruiert, daß er einen Überhang besitzt, welcher komplementär zum Ende des anderen Moleküls ist
Wie werden synthetische Gene mithilfe der PCR hergestellt, zeichen Sie ein Schema!
Manche Organismen bevorzugen manche Codons mehr als andere. Synthetische Gene → um Codons einzubringen, die vom Zielorganismus bevorzugt werden.
Mehrere überlappende Primer werden eingesetzt → Kaskadenreaktion von Primer → Primer, die im Überschuss vorhanden sind, liefern das Endprodukt
Zeichnen Sie ein Schema einer PCR-basierenden Sequenzdeletion, vergleichen sie einen 2- mit einem 4-Primer-Ansatz!
2-Primer-Ansatz: Deletion nahe am 3’- oder 5’-Ende
4-Primer-Ansatz: Deletion in der Mitte
Was versteht man unter Inverser PCR, zeichnen Sie ein Schema!
Methode, um unbekannte Genbereiche, die von bekannten Gen-Bereichen benachbart sind, zu isolieren und zu amplifizieren
Prinzip
- ausgehend von kurzem, bekanntem DNA-Abschnitt: Primer, die voneinander weg in Richtung unbekannte Sequenz orientiert sind
- dazwischen Restriktionsstelle (in bekannter Sequenz = R”)
- Verdau mit Restriktionsenzym, das in unbekanntem Bereich schneidet = R1
- Annealing: geschnittene DNA-Fragmente zirkularisieren
- dann: Schnitt mit R2 (hat Schnittstelle in bekanntem Bereich zwischen Primern)
→ man erhält bisher unbekannten Bereich, der zwischen zwei zueinandergerichteten Primern liegt
bei Einführung einer Deletion → der zu deletierende Sequenzbereich durch Primer flankiert
Was versteht man unter USE-PCR, zeichnen Sie ein Schema!
USE-PCR = unique site elimination
zur Einbringung von Punktmutationen in zirkuläre DNA und gleichzeitige Entfernung von 1x vorkommender Restriktionsschnittstelle
