Arbeiten mit Nukleinsäuren Flashcards
Benennen und beschreiben sie min. 3 Methoden der Nukleinsäure Konzentrationsbestimmung?
a) OD-Messung mittels Absorptionsspektrometrie:
OD 260 = Messung der optischen Dichte bei 260 nm mittels Photometer mit UV-Lampe
Probe à in Quarzglasküvette vorgelegt àmit UV bestrahlt à Absorption der Probe
c (µg/ml) = (OD260 * V * F)
c (µmol/ml) = (OD260 * V * F) / (Mw * L)
OD260 …optische Dichte bei 260 nm Wellenlänge
V…Verdünnungsfaktor
F…Multiplikationsfaktor (50 dsDNA, 40 RNA, 37 ssDNA, 20 für Einzelstrang-Oligos)
Mw…Molekulargewicht je Base (330 g/mol) bzw. Basenpaar (660 g/mol)
L…Länge in kb
Limitierung:
- Messungen nur zwischen OD: 0,1 – 1 ≈ 5 –50 µg Nukleinsäure/ml (à „große“ Mengen nötig!)
- Keine Unterscheidung von DNA, RNA und Nukleotide möglich – Mischproben!
- Messung des Verhältnisses 260: 280 nm àProteinkontaminationen (1,8 – 2,2: hochreine Probe)
b) Agarosegel-Elektrophorese:
Probe wird auf Agarosegel aufgetragen, Nachweisgrenze bei ca. 5 ng DNA / Bande.
Durch Anlegen von elektr. Feld à wandern Nucleinsäuren (neg. geladen) durch Gelmatrix.
Auftragen von Aliquot gemeinsam mit Verdünnungsreihe (Eichreihe) à Konzentration bekannt
à durch Vergleich der Bandenintensität kann DNA-Konz. der Probe abgeschätzt werden
VT: Banden ausscheiden à weiter verarbeiten (präp. Verabeitung)
c) Dot-Quantifizierung:
abgekürzte Version von b) à Verdünnungsreihe wird mit Probe verglichen
Ethidiumbromid (EtBr)à zum Färben
NW-Grenze: 5 ng DNA/Bande
NT: Mischproben, ungenau
d) Konzentrationsbestimmung mittels Fluoreszenzfarbstoffe:
Probe mit DNA-spezifischen Fluoreszenzfarbstoff in Fluorometer
Anregung: 365nm
Messung: 420nm
Sensitivität 5-500 ng/ml
Benennen und beschreiben sie min. 4 Methoden der Nukleinsäure Markierung?
Radioaktive Methoden , Nukleotide markiert mit: - Isotopen geringer Halbwertszeit 32P, 35S,
bedenklich: - Isotopen längerer Halbwertszeit <sup>3</sup>H, <sup>14</sup>C
Nichtradioaktive Methoden, Nukleotide markiert mit: - Biotin
- Digoxigenin (DIG...Steroid)
- Fluoreszein a) _Endmarkierung_: Austausch der Phosphatgruppe am **5’OH Ende** der Nukleinsäure durch **radioaktives Phosphat (<sup>32</sup>P)** von **ATP** durch **Polynukleotidkinase**; 3. P auf ATP = radioaktiv
Dephosphorylierung: mittels alkalischer Phosphatase
b) Nick-Translation: DNA-Polymerase I kann beginnend an einem Bruch (=NICK) im Phospho-diesterrückrat der DNA den alten Strang abbauen und einen neuen synthetisieren
à serieller Einbau von radioaktiven Nukleotiden
c) Primerverlängerung: Denaturierung der DNA, Anlagerund eines Zufallsprimers (Hexanukleotidmix), Klenow-Fragment kopiert Matrize vom 3´-Ende des Primers weg
à Einbau von nichtradioaktiv oder radiaktiv markierten Molekülen
d) PCR: mit einem markierten Nukleotid, 1 od. 2 Primer – Sonden für einen oder beide DNA – Stränge
Benennen und beschreiben sie min. 2 Methoden der Nukleinsäure Sequenzierung?
a) MAXAM – GILBERT:
basenspezifische chemische Spaltung von End-markierter DNA (32P) à Auftrennung der Fragmente durch Gelelektrophorese
DNA-Einzelstrang: am 5´ Ende markiert
in 4 Ansätzen werden die jeweiligen Basen modifiziert und abgespalten (Spaltung des Strangs)
G/A mit DMS methyliert à methylierte As/Gs: Schnitt mit HCl à meGs: Schnitt mit Piperidin
C/T mit Hydrazin modifiziert
in jedem Ansatz entstehen Fragmente unterschiedlicher Länge
Auftrennung mittels Gelelektrophorese
Nachteil: gefährliche Reagenzien, schwer automatisierbar, dauert lange
a) SANGER – COULSON (Didesoxymethode):
Denaturierung der dsDNA à Hybridisierung mit Primer à in 4 Ansätzen (alle beinhalten alle 4 Basen) wird je eine der 4 Basen als ddNTP (radioaktiv markiert) zugegeben à Klenow-Fragment synthetisiert Tochterstrang bis eingebautes ddNTP, dann stoppt Poly. à Fragmente unterschiedli. Länger werden mittels PAGE aufgetrennt
Welche Elektrophorese Methoden für Nukleinsäuren kennen sie (beschreiben sie min. 3) wozu werden sie angewandt, welche Trennleistungen können erzielt werden?
a) native Agarosegelelektrophorese: zur Analyse und präparativen Isolierung von ds- und ss-DNA-Fragmenten, und Plasmid-DNA mit einer Länge von > 0.3 – ca. 50 kb (300 – 50.000 bp)
à Probe wir auf Agarosegel aufgetragen à Anlegen eines elektrischen Feldes à Nukleinsäuren (neg. geladen) wandern durch Gelmatrix à Auftrennung durch Siebwirkung; EtBr zum Färben
Referenzprobe mit bekannter Konzentration (Eichreihe) läuft mit
Trenneigenschaften: je höher Agarose-Konz., desto kleinere Fragmente trennbar
b) denaturierende Agarosegelelektrophorese:
DNA: zur Analyse von ssDNA à alkalische Laufbedingungen über 50 mM NaOH
RNA: Denaturieren der RNA mit Formaldehyd (50°C), Gel mit Formaldehyd
Denaturieren der RNA mit DMSO (50°C) + kovalenter Modifikation mit Glyoxal, natives Gel
c) native PAGE (Polyacrylamidgelelektrophorese): zur Trennung von dsDNA-Molekülen
à Acrylamidkonzentration von Kettenlänge und Farbmarker (zB Bromphenolblau) abhängig Trennleistung: 6-2000bp
d) denaturierende PAGE: zur Trennung von ssDNA-Molekülen, mit Harnstoff als Denaturant
à Acrylamidkonzentration von Kettenlänge und Farbmarker (zB Bromphenolblau) abhängig
Trennleistung: 2-500bp
Benennen und beschreiben sie min.3 Methoden zum Färben von Nukleinsäuren in Elektrophoresegelen.
a) Ethidiumbromid: UV-Anregung
Färben der Gele für ca. 30 min in einer 0,5 µg/ml EtBr-Lösung;
Alternative: Zugabe von 0,1 µg/ml EtBr zum Gel
Sensitivität: ca. 20 ng/Bande
b) Methylenblau: UV unabhängig, irreversible Färbung
Färben der Gele ca. 15 min mit 0,02% Methylenblau Lösung in H2O
Sensitivität: 40 ng/Bande
c) Sensitivere Alternativen: UV-Anregung
SYBR Green I, SYBR Green II, OliGreen, PicoGreen
Sensitivität: 5 ng/Bande
Benennen und beschreiben sie 5 Methoden der Nukleinsäure Hybridisierung, wofür werden sie verwendet.
Hybridisierung: an DNA Einzelstrang wird ein komplementärer DNA/RNA Einzelstrang über Wasserstoffbrückenbindung angelagert
a) Southernblot: NW von DNA
DNA wird elektophoretisch nach Größe aufgetrennt à auf Membran transferiert = BLOTTEN
à Hybridisierung mit markierter Sonde nachgewiesen
b) Northernblot: Nachweis von mRNA
à Prinzip wie Southern Blot
c) Dot-Blot: NW von RNA und DNA OHNE Größenauftrennung
à Probe: auf Nitrocellulosemembran fixiert à mit komplementärer, markierter DNA überschichtet
d) In-situ Hybridisierung: NW von Expression von mRNA in Geweben, Position von Genen in Chromosomen
e) Kolonie/Plaque Hybridisierung: NW von DNA in Bakterienkolonien oder Bakteriophagen
Beschreiben sie eine Methode zur spezifischen Reinigung eukaryontischer mRNA?
→ über Poly-A-Schwanz am 3’OH Ende der mRNA à Binden von Oligo(dT)s an Zellulose in Affinitätschromatografie-Säule → nur mRNAs bleiben an Säule hängen → Auswaschen der mRNA mit hoch- und niederkonzentrierter Salzlösung → gereinigte mRNA fliesst aus der Säule ab und wird durch EtOH gefällt (EtOH im Überstand, mRNA unten)
Wie kann mit Hilfe der OD-Messung die Konzentration von Nucleinsäuren bestimmt werden. Geben sie entsprechende Formeln für (dsDNA, ssDNA, Oligonucleotide) an.
→ dsDNA:
c [µmol/ml] = (OD260 * V ) / (13,2 * L)
→ Oligonukleotide und ssDNA:
c [µmol/ml] = (OD260 * V ) / (10 * L)
Wie wird für DNA/DNA Hybridisierungen die geeignete Hybridisierungs Temperatur berechnet? Nennen sie empirisch errechnete Richtwerte?
Tm = 81,5°C - 16,6 (log10 [Na+] ) + 0,41 (%G + C) - 0,63 (%Formamid) – 600 / L
Tm…Temperatur, bei der die Hälfte der Nukleotide in der Doppelhelix dissoziiert sind
Hybridisierungs-Topt: Tm- 25°C
[Na+]…Natriumionenkonzentration in mol/L
G + C … Anteil von Guanosin und Cytosin
L…Länge der Sonde in b
empirisch Werte:
Spezifisch (homologe) Hybridisierung: 64-65°C (DNA/DNA)
42°C bei 50% Formamid (RNA)
Welche nichtradioaktiven DNA Makierungs/Nachweistechniken kennen sie? Worauf beruhen die jeweiligen Techniken?
a) Farbnachweis: durch dunkle Farbniederschläge
→AK, an dem Enzym bindet, bindet an Probe (eigentlich an markierter Sonde komplementär zur membrangebundenen DNA) àSubstrat reagiert mit Enzym unter Bildung eines Farbstoffes (Licht);
Enzym: alkalische Phosphatase (AP) mit Nitroblautetrazolium (NBT)
Meerrettichperoxidase (**HRP**) mit **Chloronaphtol**
b) Chemiluminiszenz: NW von AP bzw. HRP mit chemiluminiszenten Substraten.
c) Fluoreszenz: NW von AP und HRP mit fluorogenen Substraten (Fluoreszein)
→ Anregung durch Laser notwendig
→ Vermessen mittels Scanner (Quantifizierung)
